溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是炎症性肠病的一种主要亚型，其特征是起源于直肠并逐渐向近端蔓延的连续的黏膜及黏膜下病变，主要发病于20~49岁的人群。典型症状为黏液脓血便，并伴有腹泻、腹痛、里急后重等，严重者可出现发热、体重下降等全身性症状。约27%的患者有肠外受累，如关节、皮肤黏膜、眼部、肝脏、胆道系统病变和血栓栓塞性疾病[1-3]。UC的病因和发病机制仍不完全清楚，主要受环境、遗传和免疫系统失调等因素的综合影响。中性粒细胞作为肠道固有免疫的重要组成部分，通常最先聚集在炎症部位，发挥抗菌和抗炎作用[4]。组织病理学显示，UC患者肠黏膜的中性粒细胞浸润表明肠道内稳态被破坏，可能是UC的关键病理生理过程。中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）于2004年首次被发现，它由细胞外染色质结构组成，这些染色质结构被组蛋白和各种颗粒蛋白装饰[5]。中性粒细胞通过产生活性氧、释放裂解酶和部署NETs来增强其抗菌功能。然而，过多的NETs形成会损害周围正常组织[6]。研究表明，NETs失调参与多种自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、牛皮癣、类风湿关节炎和UC[7-9]。UC患者结肠活检中NETs相关蛋白水平升高[10]，REDD1/NETs/IL-1轴在UC的发病中起关键作用[11]，NETs通过肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）促进UC炎症发展[12]。此外，NETs会损害肠道屏障，导致细菌易位和肠道炎症。提示NETs可能参与UC发病，但具体机制尚不完全明确。本研究使用RNA测序数据来探索NETs在UC中的潜在作用，通过机器学习识别关键基因并构建诊断模型，分析这些关键基因的表达谱来分类与NETs相关的独特亚型，探索NETs在UC中可能的作用机制，为UC疾病诊断和个性化治疗提供参考。
1 资料与方法
1.1 微阵列数据集和NETs相关基因
本研究数据来源于Gene Expression Omnibus（GEO）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），包括GSE116222、GSE87466、GSE16879、GSE73661和GSE206285数据集。GSE116222包含来自结肠活检的单细胞RNA测序（scRNA-seq），包括3例健康个体（健康组）和3例UC患者病变区域（炎症组）的样本。GSE87466纳入87例UC患者和21例正常对照，GSE16879纳入24例未使用生物制剂的UC患者和6例正常对照。GSE73661包含44例使用维得利珠单抗（VDZ）治疗的UC患者，23例使用英夫利昔单抗（IFX）治疗的UC患者和12例正常对照。GSE206285包括364名接受乌司奴单抗（UST）治疗的UC患者，186名接受安慰剂治疗的患者和18名健康对照者。其中，数据集GSE87466和GSE73661仅使用基线数据。NETs相关基因（NRGs）来源于Zhang等[13]在癌症中鉴定的69个NRGs，其整合了NETs在多种免疫和相关疾病中的基因，主要包括刺激NETs形成的配体和受体、下游相关信号以及鉴定出的黏附在NETs框架下的分子。本研究的设计流程图见附件图1。
1.2 scRNA-seq数据处理与分析
使用R语言Seurat包处理scRNA-seq数据，质控标准为核糖体基因大于3%，线粒体基因小于15%，红细胞基因小于0.1%，细胞表达基因小于7 500个。使用harmony包去除批次效应，使用ScaleData函数执行数据规范化。随后进行主成分分析（principle component analysis，PCA），使用RunUMAP函数降维。通过FindClusters函数（分辨率设置为0.8）实现细胞聚类，使用SingleR包进行细胞类型注释。使用FindAllMarkers函数在不同的集群中识别标记基因。从MSigDB数据库（http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp）提取hallmark通路，使用GSVA包对这些通路评分，并用pheatmap包进行可视化。
1.3 差异表达基因的数据处理与鉴定
通过R语言sva包完成RNA测序的数据集整合，用limma包去除批次效应，并用FactoMineR和factoextra包生成PCA图来评估[14]。为减少异常值的影响，使用preprocessCore包进行数据归一化，使用limma包检测差异表达基因（differential expression genes，DEGs），调整P值＜0.05，绝对对数倍变化＞0.5。利用火山图和热图将DEGs可视化。将DEGs与NRGs相交的子集定义为DE-NRGs，并使用维恩图显示。
1.4 功能富集分析及蛋白-蛋白相互作用网络构建
使用R语言clusterProfiler包进行GO分析和KEGG通路分析，以及单基因基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。利用GSVA包进行基因集变异分析（gene set variation analysis，GSVA），确定不同亚型之间生物学途径的差异。使用STRING数据库（https://string-db.org/）构建PPI网络。
1.5 机器学习
使用两种机器学习方法识别潜在的关键基因。使用R语言glmnet和randomForest包分别进行Lasso回归和随机森林算法[15]。通过这两个基因群的交集确定关键基因，并通过circlize包进行可视化。
1.6 关键基因的qRT-PCR验证
从武汉大学中南医院招募了16例确诊为活动性UC的患者，所有UC患者都诊断明确，并均未接受免疫抑制剂、类固醇或生物制剂的治疗。UC患者的结肠黏膜组织在内镜手术或手术中取得并保存在液氮中。同时选取16例年龄和性别匹配的健康志愿者作为对照组。本研究已获得武汉大学中南医院医学伦理委员会批准（批号：科研论[2022011K]）。
使用TRIzol试剂（Invitrogen，美国）从结肠黏膜组织中提取总RNA，使用TOYOBO ReverTra Ace试剂盒（TOYOBO，日本），按照制造商的说明将每个RNA样品转化为cDNA。使用UltraSYBR混合物（CWBIO，中国）进行qRT-PCR，用LightCycler96实时荧光PCR仪（Roche，美国）进行mRNA表达的定量。采用2-ΔΔCt定量方法，以人GAPDH为内参。引物由中国武汉青岛生物科技有限公司生产，引物序列见表1。
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表格1 引物序列
Table1.Primer sequence
1.7 免疫浸润分析
ssGSEA是一种广泛应用于免疫浸润分析的技术。通过R语言GSVA包实现ssGSEA功能，评估UC和对照样品的免疫学特性。使用ggplot2包将关键基因与免疫细胞浸润的相关性可视化，重点关注有显著相关性的免疫细胞（P＜0.05）。
1.8 诊断模型的构建与验证
采用mlr3框架构建8种分类模型（逻辑回归、LDA、SVM、朴素贝叶斯、KNN、决策树、随机森林和XGBoost）。模型参数设置如下：随机森林包含1 000棵决策树，XGBoost设置100轮迭代和0.3学习率，SVM使用径向基核函数（C=1，gamma=0.1）。通过5折交叉验证重复10次评估模型性能，采用分层抽样保持类别平衡。最终选择交叉验证AUC值最高的模型进行外部验证，使用pROC包计算测试集AUC及其95%CI。
1.9 NETs相关基因表达亚型的鉴定
数据准备：从UC患者基线期（Week 0）基因表达矩阵中提取目标基因，进行log2转化和标准化处理。采用非负矩阵分解（NMF）对基因表达数据进行多秩分析（k=1-10），通过100次迭代计算各秩的Cophenetic相关系数以评估聚类稳定性。选择Cophenetic值首次显著下降前的秩（k=2）作为最佳聚类数。使用brunet算法构建k=2的分解模型，迭代100次至收敛。根据系数矩阵将样本划分为2种表达亚型。共识矩阵热图：通过consensusmap函数展示样本共聚类概率，矩阵块状结构反映亚型内一致性。采用Wilcoxon检验评估亚型间连续变量（如发病时间）差异，卡方检验分析分类变量差异。通过MCP-counter算法计算免疫细胞丰度，利用热图及箱线图可视化亚型间浸润差异。
1.10 药物预测
DGIdb（Drug-Gene Interaction Database）是一个包含基因、基因产物、药物和药物-基因相互作用的在线数据库[16]。利用该数据库预测针对关键基因的潜在药物。
1.11 统计学分析
使用R 4.2.2软件进行统计学分析。采用配对t检验评估UC组与对照组靶基因相对mRNA表达水平的差异。采用Wilcoxon检验评估UC两种亚型之间连续变量的差异。采用Spearman相关分析来评价相关性。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 NRGs的scRNA-seq数据分析、富集分析和细胞类型特异性分析
从GSE116222数据集中获得UC患者和健康志愿者结肠活检样本的scRNA-seq数据。通过降维和UMAP可视化，鉴定了18个细胞簇，并将其注释为6种细胞类型，包括上皮细胞、自然杀伤细胞（natural killer，NK）细胞、普通髓系祖细胞 、巨噬细胞、T细胞和B细胞。随后，对每种细胞类型的标记基因进行鉴定，并描绘出每种细胞类型中表达水平最高和最低的前5个基因（附件图2）。检测NRGs在各细胞类型中的表达水平，与其他细胞类型相比，巨噬细胞中NRGs的表达量最多，根据NRGs的细胞个体表达相对于各自细胞类别中的平均表达水平将细胞分为高分组和低分组，结果显示，免疫细胞在高分组中占主导地位（图1）。
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图1 单细胞亚群水平的NETs相关基因分析
Figure1.Analysis of NETs-related genes at the single-cell subpopulation level
注：A.不同细胞类型NETs相关基因表达水平点图；B.不同细胞类型NETs相关基因表达箱式图；C.不同细胞类型中NRGs表达水平和NETs评分UMAP图；D.NETs评分高、低组中不同细胞类型的平均细胞数及相对比例。
2.2 DEGs筛选及功能富集分析
去除GSE87466和GSE16879的批次效应后，得到138例样本的数据集，对数据进行标准化，在UC和对照样本之间共鉴定出3 278个DEGs，其中包括1 831个上调基因和1 447个下调基因，热图显示前20个上调和下调的基因（图2）。GO分析显示，与细胞因子产生、受体配体活性、含胶原的细胞外基质、信号受体激活剂活性、质膜外侧和细胞黏附相关的DEGs显著富集，KEGG分析显示细胞黏附分子、趋化因子信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用的通路显著富集（附件图3）。
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图2 筛选常规转录组测序数据集的差异表达基因
Figure2.Screening for DEGs in conventional transcriptome sequencing datasets
注：A.整合数据集GSE87466并去除批次效应；B.整合数据集GSE16879并去除批次效应；C.对整合数据集GSE87466进行标准化处理；D.对整合数据集GSE16879进行标准化处理；E.绘制火山图对DEGs进行可视化；F.热图显示了差异表达基因。
2.3 DE-NRGs的选择与分析
在UC组与对照组之间共筛选出38个DE-NRGs，除SLC22A4外，UC组中所有基因均上调(附件图4)。功能分析表明，DE-NRGs在白细胞迁移、促炎细胞因子产生、分泌颗粒膜、免疫受体活性、细胞因子-细胞因子受体相互作用中富集。KEGG富集分析显示，与疟疾、NETs形成、利什曼病、军团菌病和金黄色葡萄球菌感染相关的通路显著富集（图3）。使用STRING数据库生成38个DE-NRGs的PPI网络（附件图5）。
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图3 NETs相关差异表达基因的鉴定和功能分析
Figure3.Identification and functional analysis of DEGs related with NETs
注：A.维恩图显示了NETs相关基因与表达上调基因的交集；B.维恩图显示了NETs相关基因与表达下调基因的交集；C.DE-NRGs的GO富集分析；D.DE-NRGs的KEGG富集分析；E.KEGG分析中富集最显著的5条通路与基因的对应关系。
2.4 关键DE-NRGs的选择与分析
应用Lasso回归和随机森林算法检测DE- NRGs的特征，分别筛选出10个和15个基因，其中重叠的4个基因SLC25A37、F3、PTAFR和MME被鉴定为关键基因，它们之间存在显著的正相关（图 4）。收集16例UC患者和16例健康志愿者的肠黏膜样本进行qRT-PCR分析，结果显示，UC患者中关键基因的mRNA表达水平较健康志愿者显著增加（图5）。
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图4 NETs相关关键基因的鉴定
Figure4.Identification of key genes associated with NETs
注：A.Lasso回归检测DE-NRGs中的特征基因；B.随机森林算法检测DE-NRGs中的特征基因；C.NETs相关关键基因；D.NETs相关关键基因相关性分析。
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图5 在人体标本中验证关键基因的mRNA表达
Figure5.mRNA expression of key genes in human specimens
注：A.F3在UC和正常对照的mRNA表达水平；B.MME在UC和正常对照的mRNA表达水平；C.PTAFR在UC和正常对照的mRNA表达水平；D.SLC25A37在UC和正常对照的mRNA表达水平；*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1。
2.5 免疫浸润及单基因GSEA分析
免疫浸润分析显示，除CD56dim NK细胞外，大多数浸润性免疫细胞与UC之间存在显著的正相关，UC组中CD56dim NK细胞的丰度较对照组更低，而其他免疫细胞的丰度水平均较高，4个关键基因与大多数免疫细胞（如中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞）的浸润呈较强的正相关，与CD56dim NK细胞浸润呈负相关（图6）。单基因GSEA分析显示关键基因与细胞因子信号、白细胞介素信号、细胞外基质组织和胶原形成相关的通路存在正相关，与呼吸电子传递呈负相关（图 7）。
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图6 免疫浸润分析
Figure6.Immunoinfiltration analysis
注：A.UC患者免疫浸润细胞相关性热图；B.UC组与对照组23个免疫细胞的浸润差异；C.4个关键基因与免疫细胞的相关性；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
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图7 4个关键基因的单基因GSEA脊图
Figure7.Single gene GSEA ridge map of 4 key genes
2.6 诊断模型的构建及评价
使用不同的机器学习算法构建8个诊断模型，每个模型的稳健性通过在训练集上进行10次重复的五折交叉验证来测试。所有模型的AUC均大于0.75，表明具有较强的诊断效能，重复五折交叉验证的结果显示，8个模型均具有较好的稳定性，其中朴素贝叶斯算法构建的模型性能最好。因此，在GSE73661和GSE206285中选择该模型进行外部验证，朴素贝叶斯模型在上述两个外部验证集的AUC分别为0.792和0.921，表明该模型对UC的诊断价值较高（图8）。
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图8 基于关键基因的诊断模型构建及有效性验证
Figure8.Construction and validation of diagnostic model based on key genes
注：A.诊断模型AUC箱线图；B.重复五折交叉验证的ROC曲线；C.数据集GSE73661验证朴素贝叶斯模型的ROC曲线；D.数据集GSE206285验证朴素贝叶斯模型的ROC曲线。
2.7 NETs相关亚型的鉴定与分析
使用NMF算法，确定不同的NETs相关亚型，并将GSE73661数据集的UC患者分为两个亚型，其中亚型1的关键基因的表达水平更高，在这两个亚型中鉴定出1 591个DEGs。GO和KEGG富集分析显示，这些DEGs与T细胞活化、细胞因子产生的正调节、细胞因子-细胞因子受体相互作用相关（附件图6）。在生物途径差异方面，亚型1在各种免疫炎症反应途径中大量富集，包括白细胞介素相关信号通路、干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）反应和通过NF-κB介导的TNF-α信号通路（附件图7）。除CD56bright NK细胞、CD56dim NK细胞和辅助T细胞17（Th17细胞）外，亚型1中免疫细胞的浸润程度显著高于亚型2。根据UC患者对不同生物制剂的反应和临床活动度对其进行了分层，亚型2患者对IFX治疗的反应率更高，临床活动度更低，但两类患者对VDZ治疗的反应率无统计学差异（图9）。
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图9 基于关键基因的两个NETs相关亚型的鉴定与分析
Figure9.Identification and analysis of two NETs-related subtypes based on key genes
注：A.在数据集GSE73661中，通过NMF算法将UC患者分为2个亚型；B.2个亚型的聚类分析；C.2个亚型的关键基因的表达差异；D.2个亚型的Hallmarks通路富集分析；E.2个亚型的免疫浸润分析；F.2个亚型对生物制剂的治疗反应和临床活动度的差异；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
2.8 靶向药物预测
在DGIbd在线数据库中检索22种药物靶向F3、MME、PTAFR和SLC25A37基因的药物，其中靶向F3的药物5种，靶向PTAFR的药物6种，靶向MME的药物11种，未报道靶向SLC25A37的药物，其中靶向PTAFR的药物DERSALAZINE已完成II期临床试验（表2）[17-18]。
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表格2 靶向关键基因的药物
Table2.Drugs targeting key genes
3 讨论
UC的确切发病机制尚不明确，但普遍认为与遗传易感性和环境因素有关，肠道屏障受损导致食物抗原和细菌的易位，从而使中性粒细胞聚集[19]。NETs通过分解细菌毒力因子和杀死细菌来增强抗菌活性，在中性粒细胞清除病原体的过程中发挥重要作用；NETs还可作为物理屏障，防止感染的进一步扩散。NETs在UC中展现出双面性，在有效消灭微生物的同时，也会损伤肠上皮细胞，破坏肠上皮屏障的完整性[20]。本研究发现4个NETs相关的关键基因（F3、MME、PTAFR、SLC25A37）可能参与UC的发病和进展，有望成为诊断生物标志物和治疗靶点。
凝血因子III（coagulation factor III，F3），又称组织因子，是外源性血凝级联反应的主要启动因子[21]。F3可通过蛋白酶激活受体促进炎症信号传导，导致IL-1、IL-6、TNF-α等细胞因子的合成以及其他促炎信号的合成，在炎症反应中，DNA纤维或核染色质释放到细胞质中，与细胞质蛋白、颗粒蛋白、组蛋白和F3结合，包裹细胞质，最终形成NETs，导致组织损伤[22]。在UC中，F3可能通过参与NETs的形成从而发挥促炎作用。膜金属内肽酶（membrane metalloendopeptidase，MME）是一种跨膜糖蛋白，在系统性红斑狼疮、牙周炎等炎症中表达上调，且与疾病的严重程度呈正相关，MME主要在中性粒细胞和成纤维细胞上表达，表明MME可能通过调控中性粒细胞的免疫反应形成NETs在UC中发挥促炎作用 [23- 25]。血小板活化因子受体（platelet-activating factor receptor，PTAFR）主要分布在巨噬细胞和中性粒细胞中，是NETs形成的重要调控因子，在慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、类风湿性关节炎和炎症性肠炎等炎症性疾病中发挥重要作用，参与炎症性肠炎肠外表现的调节，在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，PTAFR的表达上调，其作用机制是通过NLRP3炎性小体激活IL-1β发挥促炎作用，提示在UC患者发病过程中可能通过类似的机制发挥促炎作用[26-29]。编码丝裂铁蛋白-1的溶质载体家族25成员37（SLC25A37）基因与多发性硬化和骨关节炎等炎症密切相关，在小鼠败血症模型中发现SLC25A37在外周血中性粒细胞中表达升高，提示SLC25A37在细菌性炎症中的抗菌作用。SLC25A37基因有转录因子RelB的结合位点，推测在UC中在TNF-α刺激下可能通过非经典NF-κB通路调控SLC25A37基因表达发挥促炎作用[30]。
本研究发现4个关键基因之间存在正相关，提示潜在的协同效应。免疫浸润分析表明，这些基因与大多数免疫细胞（包括中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞）的浸润呈正相关，而与CD56dim NK细胞的浸润呈负相关。单基因GSEA结果显示，关键基因与免疫系统细胞因子信号转导、胶原形成、细胞外基质组织和白细胞介素信号转导呈正相关。这些发现与UC患者肠道的免疫细胞浸润一致。UC的炎症反应和细胞因子信号通路由多种免疫细胞驱动，包括巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、T细胞和B细胞 [31- 32]。免疫细胞浸润和激活后释放细胞因子（如IL- 1β、IL-6、IL-23、TNF、IFN-γ和与T辅助17细胞途径相关的细胞因子）进入肠黏膜和外周循环，发挥促炎作用[33-34]。胶原蛋白是肠道细胞外基质的重要组成部分，在UC病理状态下，包括中性粒细胞弹性酶（NETs的组成部分）在内的蛋白酶活性增加，破坏了细胞外基质降解和合成之间的平衡，影响肠道组织稳态，最终导致组织损伤和无效愈合[35]。呼吸电子传递是真核生物线粒体的基本功能，线粒体功能障碍与结肠炎症密切相关，在活动性UC患者中，线粒体功能明显下调[36]。
本研究通过NMF分析将UC患者分为2种亚型，其中关键基因均在亚型1中高表达。GSVA和免疫浸润分析显示，亚型1的炎症反应增强。此外，这两个亚型对生物制剂的反应和临床活动度也不同，亚型2的患者IFX治疗的有效率更高，临床活动度更低。既往研究表明，UC患者外周血中TNF-α刺激中性粒细胞可诱导NETs形成，NETs反过来刺激固有层单核细胞TNF-α的分泌形成正反馈，形成炎症的恶性循环，而抗TNF-α治疗可打破这一循环，控制炎症，缓解临床症状 [37]。DERSALAZINE是唯一报道的用于UC的药物，其由PTAFR拮抗剂和5-ASA组成的化合物。一项在轻度至中度UC患者中进行的为期4周的II期临床试验表明，DERSALAZINE比美沙拉秦更有效，但差异无统计学意义，其临床价值有待进一步研究证实[38]。
本研究也存在一定的局限性。朴素贝叶斯模型表现出了较高稳定性和良好性能，但在临床应用中仍面临挑战，医生可能需要更多信息来支持临床决策，数据质量和一致性是影响模型泛化能力的关键，优化运行效率和提升跨平台兼容性将有助于推动临床实际应用。本研究基于生物信息学，不能模拟真实病理过程，结论的可靠性有待进一步验证。虽然在人体标本上验证了关键基因的表达，但样本量较少，未来仍需更大样本量的研究验证。
综上，本研究通过生物信息学方法，确定了4个关键基因，建立了良好的诊断模型，并鉴定出两个独特的NETs相关亚型，为制定新的诊断标志物、治疗靶点和制定个性化治疗策略提供依 据。
附件见《医学新知》官网附录（https://yxxz.whuznhmedj.com/futureApi/storage/appendix/202412002.pdf）
伦理声明：本研究已获得武汉大学中南医院医学伦理委员会批准（批号：科研论[2022011K]）
作者贡献：研究设计、数据采集、数据分析、论文撰写：孟秋月、袁一帆、李娜；实验操作：卢嘉莉；论文审定、经费支持：叶梅
数据获取：本研究中使用和（或）分析的数据可在Gene Expression Omnibus（GEO）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）获取
利益冲突声明：无
致谢：不适用
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