前列腺癌（prostate cancer，PCa）在全球男性恶性肿瘤发病率中居第二位，亦是癌症相关死亡的第八大病因。2022年全球癌症统计数据显示，全球新发PCa病例146万例，位居全部恶性肿瘤第四位［1］ 。年龄是PCa公认的危险因素，2022年美国60~69岁男性PCa患病率为1.8%，而70岁及以上人群患病率增至9.0%［2-3］ 。近年来，我国PCa发病率呈上升趋势，已成为威胁我国老年男性健康的重要公共卫生问题［4-5］ 。
PCa常规筛查包括直肠指检和血清前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）检测。健康男性PSA水平 < 4 ng/mL，若血清PSA水平 > 10 ng/mL则需排查PCa风险［6］ 。然而，PSA并非PCa的特异性标志物，良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）、前列腺炎等亦可导致其水平升高，尤其是当PSA处于灰区（4~10 ng/mL）时，其诊断敏感性和特异性显著下降［7］ 。因此，探索新的血清标志物有助于PCa的早期筛查与监测，为老龄化“主动健康”提供新的思路和方法。
SERPINA3是编码α1-抗胰凝乳蛋白酶（α1-antichymotrypsin，AACT）的基因，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，能够拮抗丝氨酸蛋白酶活性。AACT在炎症反应、免疫调节等生物过程中发挥关键作用，与多种临床疾病密切相关［8-9］ 。研究表明，AACT高表达会促进乳腺癌细胞的转移和上皮-间质转化，在早发性结直肠癌中，AACT显著上调，可作为早发性结直肠癌的诊断和预后标志物［10-11］。然而，SERPINA3在PCa诊断中的相关研究较少，本研究旨在探究SERPINA3基因编码的AACT在PCa中的表达水平、诊断效能及临床意义，以期为PCa的早筛早诊提供新的血清生物标志物。
1 材料与方法
1.1 数据来源
本研究中PCa患者转录组数据下载自癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA，https：//portal.gdc.cancer.gov）数据库，通过提取TPM格式数据并进行Log2（TPM+1）归一化处理，提取PCa样本及健康对照的SERPINA3表达量，并进行后续分析。
基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库相关数据集以MINiML格式下载。对于未进行归一化处理的数据集，统一进行Log2转换后进行后续分析。根据平台注释信息，将SERPINA3探针ID转换为gene symbol，并提取该基因在不同样本中的表达水平，
1.2 单样本基因集富集分析
从TCGA下载PCa STAR-counts数据，提取数据并归一化处理后，收集不同信号通路对应的基因表达信息，利用R 4.0.3软件中GSVA包，参数method=‘ssgsea’进行单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）。
1.3 临床样本采集与ELISA检测血清AACT水平
采集2022年1月至2022年11月于武汉大学中南医院就诊或体检人群的血清样本。
PCa患者纳入标准：①经前列腺穿刺病理活检确诊PCa；②初诊且既往未接受任何抗肿瘤及前列腺相关治疗；③年龄 ≥ 50岁的男性。BPH患者纳入标准：①经直肠超声、尿流动力学检查及临床症状评估确诊BPH；②初诊且既往未接受任何抗BPH相关药物治疗及手术干预；③年龄 ≥ 50岁的男性。健康对照人群纳入标准：①影像学诊断前列腺体积正常（< 4 cm × 3 cm × 2 cm）；②无前列腺良恶性疾病；③年龄 ≥ 50岁的男性。
排除标准：①合并其他恶性肿瘤、自身免疫性疾病、严重肝肾心肺功能异常；②临床资料、血清标本不完整，无法完成后续指标检测。
采集受试者外周静脉全血2 mL，1 600 × g离心后留存血清，-20 ℃保存。ELISA检测开始前，将血清样本室温复温平衡，根据AACT酶联免疫试剂盒（CSB-E08957h，华美生物工程有限公司）说明书操作，完成各组样本检测后，根据标准曲线计算血清AACT水平。本研究已获武汉大学中南医院伦理委员会批准（批号：科伦［2021124］）
1.4 统计学分析
采用SPSS 27.0软件进行统计分析，采用GraphPad Prism 10.1.2软件绘图。连续变量以中位数和四分位数［M（P25，P75）］表示，组间比较采用Mann Whitney U检验；配对样本分析采用Wilcoxon符号秩检验；SERPINA3表达水平与通路得分相关性采用Spearman秩相关分析。采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）及其曲线下面积（area under the curve，AUC）评估血清AACT表达水平对PCa的诊断效能。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PCa组织中SERPINA3表达水平
在TCGA PCa队列中，PCa组织中SERPINA3表达水平显著高于正常组织（图1-A）；此外，在 5个GEO数据集中，PCa组织中SERPINA3表达显著上调（图1-B至1-F）。分析配对癌组织和癌旁组织，同样发现癌组织中SERPINA3显著上调（图1-G至1-H）。综上，SERPINA3基因在PCa组织中表达水平明显高于正常对照或癌旁组织，提示该基因可能为PCa诊断的新标志物。
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图1 PCa组织与正常组织中SERPINA3基因表达水平
Figure1.Expression level of SERPINA3 gene in prostate cancer tissues and normal tissues
注：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.000 1。
2.2 不同临床特征患者SERPINA3表达水平
根据GEO数据集患者不同临床特征分组比较SERPINA3表达水平。结果显示，与健康对照相比，早期未转移PCa组织SERPINA3表达水平显著升高；而转移性PCa SERPINA3表达水平低于早期未转移PCa，且与健康对照组差异无统计学意义（图2-A至2-C）。预后良好和肿瘤进展2组患者SERPINA3表达水平差异无统计学意义（图2-D）。与健康对照组相比，Gleason分级低风险（5~6级）和中风险（7级）组中SERPINA3表达水平显著上调（图2-E）。T分期分析显示，与健康对照组相比，T1、T2期PCa患者肿瘤组织中SERPINA3表达水平显著升高，T3期表达差异则无统计学意义（图2-F）。
上述结果提示，SERPINA3在PCa发生早期发挥重要作用，而在肿瘤侵袭、转移等进展过程中可能未参与调控或存在负向调控效应。
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图2 不同临床特征患者SERPINA3表达水平差异
Figure2.Differences in SERPINA3 expression levels in patients with different clinical characteristics
注：A、B、C.癌症不同进展患者SERPINA3表达差异；D.不同预后患者SERPINA3表达差异；E.不同Gleason分级患者SERPINA3表达差异；F.在不同T分期患者SERPINA3表达差异；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，ns.P ≥ 0.05。
2.3 诊断效能分析
共纳入26例健康对照者及28例BPH、29例PCa患者的血清样本，采用ELISA方法检测患者血清AACT蛋白含量。BPH患者血清中AACT含量与健康对照者差异无统计学意义，而PCa患者血清AACT含量显著高于健康对照者和BPH患者（图3-A）。ROC曲线结果显示，血清AACT用于鉴别PCa组与BPH组、PCa组与健康对照组的AUC值分别为0.968［95%CI（0.930，0.998）］、0.958［95%CI（0.910，0.994）］（图3-B）。
PCa早期诊断难点在于血清PSA灰区（4~10 ng/mL）时的良恶性鉴别，本研究筛选标本中PSA值处于灰区范围内的BPH与PCa患者，检测PSA和AACT水平。结果显示，PSA水平无法有效区分灰区的BPH与PCa患者（图3-C），而灰区PCa患者的AACT表达水平显著高于灰区BPH患者（图3-D）。上述结果表明，AACT水平在鉴别PCa与BPH方面具有良好的诊断效能，尤其对于PSA处于灰区的患者，AACT检测可作为更具优势的诊断选择。
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图3 血清AACT水平诊断效能分析
Figure3.Analysis of diagnostic efficacy of serum AACT level
注：A. ELISA检测血清AACT含量；B.基于ELISA结果数据的ROC曲线；C. PSA灰区BPH、PCa患者PSA水平；D. ELISA检测PSA灰区BPH、PCa患者血清AACT含量；***P < 0.001，ns.P ≥ 0.05。
2.4 SERPINA3与促癌通路的关系
整合多个癌症相关通路的基因集合，采用ssGSEA算法计算各样本通路富集得分，并分析其与SERPINA3表达水平的相关性。结果显示，SERPINA3基因表达水平与细胞死亡相关通路（铁死亡、细胞凋亡、TGF-β通路）、p53通路、DNA修复、DNA复制、癌症代谢相关通路（膦酸酯/次膦酸酯代谢、甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢）、炎症相关通路（炎症反应、白介素-10抗炎反应、活性氧上调基因）等显著相关（图4）。提示SERPINA3可通过调控多条生物学通路参与PCa的发生发展进程。
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图4 SERPINA3与促癌通路的相关性分析
Figure4.Correlation analysis between SERPINA3 and oncogenic signaling pathways
3 讨论
前列腺穿刺活检是PCa诊断的金标准，PSA检查是PCa筛查的常用方法，但该方法假阳性率偏高，且PSA水平受BPH、前列腺炎等多种因素干扰［12］。因此，寻找新型生物标志物以补充并完善现有筛查体系具有重要临床价值［13-14］。本研究基于公共数据库分析发现，SERPINA3基因在PC组织中高表达，临床样本ELISA检测血清AACT水平验证了这一表达特征。ROC结果显示，AACT鉴别初诊PCa与BPH、健康人群的AUC值分别为0.968、0.958。PSA灰区人群中，PCa患者血清AACT水平仍显著高于BPH患者，且表现出更优异的诊断效能。
AACT是PCa的一种致病血浆蛋白，可能与癌症进展和不良预后相关［15］。既往研究发现，AACT在不同分期肺癌中存在表达差异，早期非小细胞肺癌患者血清中糖蛋白AACT表达水平降低，在IA期尤为明显，但在晚期非小细胞肺癌中呈上升趋势［16］。SERPINA3基因编码的AACT蛋白广泛参与PCa细胞凋亡抑制、细胞自噬激活及有氧糖酵解代谢重编程等恶性生物学过程。circSERPINA3作为SERPINA3同源环状RNA，可通过海绵吸附miR-653-5p、招募BUD13蛋白稳定SERPINA3 mRNA转录后水平，正向调控SERPINA3蛋白表达，进而参与PCa的早期发生发展进程 ［17］。SERPINA3过表达可上调CXC趋化因子2表达，进而激活白介素-17和肿瘤坏死因子信号通路，促进M1型巨噬细胞向肿瘤微环境浸润，抑制PCa的进展。SERPINA3在PCa不同病程阶段呈现差异化调控效应，具有明显的作用模式异质性［18］。
本研究结果显示，SERPINA3/AACT在PCa早期显著高表达，而随着肿瘤T分期进展、Gleason分级升高及远处转移发生，其表达水平明显下降，呈现出PCa特异的分期表达模式。泛癌相关研究证实，肿瘤早期基因组结构相对稳定，RNA反向环化剪接较为活跃，促癌circRNA可正常合成；而晚期肿瘤基因组不稳定性持续增加，全基因组可变剪接调控网络紊乱失衡，导致circRNA合成受阻、表达普遍下调［19］。晚期剪接异常可使上游 circSERPINA3表达减少，其对SERPINA3 mRNA的稳定作用减弱，进而造成SERPINA3/AACT表达下调，且该过程与肿瘤基因组不稳定性的逐步累积密切相关。
PCa极易发生骨转移，成骨细胞分泌的胞外囊泡可携带SERPINA3作用于PCa细胞，通过抑制肿瘤细胞增殖与侵袭、维持骨微环境稳态，进而发挥抑癌作用［20］。疾病晚期，肿瘤细胞为逃逸骨微环境抑癌监视、实现骨定植与远处转移，可能通过适应性机制主动下调自身 SERPINA3 表达，最终导致外周血清 AACT 水平随之降低。
本研究存在一定局限性。首先，ELISA验证仅纳入PCa和BPH初诊患者，未在本中心临床样本中进一步验证AACT在PCa早期升高、进展期回落的表达规律。其次，本研究仅通过通路富集分析明确SERPINA3表达水平与多条信号通路存在显著相关性，但不能印证二者间的直接因果调控关系。SERPINA3调控PCa的具体机制有待进一步研究。
综上，本研究发现SERPINA3基因编码的AACT蛋白在PCa早期显著升高，可作为新的血清标志物，辅助临床PCa患者的早期筛查，也为PCa机制研究提供了新的方向。
伦理声明：本研究已获得武汉大学中南医院伦理委员会审批（批号：科伦［2021124］）
作者贡献：研究设计：李欣然、范俊丽；实验操作：谢欢；数据采集：谢欢、周建勇、范俊丽；数据分析与论文撰写：周建勇、李欣然；论文审定：李欣然、李一荣
数据获取：本研究中使用和（或）分析的数据可联系通信作者获取
利益冲突声明：无
致谢：不适用
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