目的  探索性别决定区Y框蛋白9（SOX9）在卵巢癌进展中的作用及机制。

方法  构建SOX9稳定敲低的卵巢癌细胞系，通过CCK-8法、Transwell实验、细胞划痕实验检测细胞增殖、侵袭和迁移能力；通过检测Fe²⁺、谷胱甘肽、丙二醛水平和Western blot实验评估敲低SOX9对卵巢癌细胞铁死亡的影响；通过共聚焦荧光显微镜观察敲低SOX9对脂质过氧化水平的影响；通过染色质免疫共沉淀结合定量PCR检测SOX9与下游靶基因SLC7A11的结合。

结果  敲低SOX9显著抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，SOX9通过调控SLC7A11的转录抑制SLC7A11/GPX4信号通路，从而激活卵巢癌细胞铁死亡。

结论  SOX9通过调控SLC7A11/GPX4信号通路促进卵巢癌细胞铁死亡，进而抑制卵巢癌的进展。

卵巢癌是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和致死率在全球范围内不断升高 [1]。卵巢癌的病理分型较复杂，其中上皮性卵巢癌最常见，约占卵巢癌的70%[2]。卵巢癌的早期诊断率较低，仅有部分患者会出现阴道出血的症状，其余症状均不显著[3]。此外由于卵巢癌细胞耐药性较强且对放化疗不敏感，大多数患者预后不佳[4]。近年来卵巢癌的靶向治疗发展迅速，但由于卵巢癌恶性程度高、肿瘤在腹腔内转移率高，卵巢癌患者5年生存率不足30%。积极寻找诊断卵巢癌的早期标志物并将其作为潜在的治疗靶点对于卵巢癌的治疗具有显著意义。

性别决定区Y框蛋白9（SOX9）基因位于染色体17q1至q1区域，长度为3 934 bp，其通过调控下游基因的表达在胚胎发育和细胞分化过程中发挥重要作用[5-6]。研究表明，SOX9在乳腺癌、甲状腺癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤中高表达，通过调控细胞增殖和代谢重编程等机制促进肿瘤进展[7]。例如，SOX9可以抑制ABCC2的转录并激活铁死亡，从而抑制胃癌细胞的增殖和侵袭[8]。铁死亡是一种铁依赖性、以脂质过氧化积累为特征的新型程序性细胞死亡方式[9-10]。研究发现，铁死亡异常激活与卵巢癌的进展、转移、复发及化疗耐药密切相关[11-13]。然而SOX9是否能通过调控铁死亡在卵巢癌进展中发挥作用尚未明确。基于此，本研究通过构建SOX9敲低的卵巢癌细胞模型，对SOX9在卵巢癌中的功能和潜在机制进行探究，以期为卵巢癌的诊治提供新的诊断标志物和靶点。

1 材料和方法

1.1 细胞和主要试剂

人正常卵巢上皮细胞ISOE-80和五种卵巢癌细胞系（Hey、ES-2、CAOV3、SKOV3、A2780）购自中科院上海细胞库。DMEM培养基（11965092）、胎牛血清（A5256701）、青霉素-链霉素（15140149）购自Gibco公司；RIPA裂解液（G2002）、蛋白酶抑制剂（G2006）、磷酸酶抑制剂（G2007）、总RNA提取试剂盒（G3607）、逆转录试剂盒（G3329）购自赛维尔生物科技有限公司；铁死亡抑制剂Fer-1（HY-100579）购自MedChemExpress公司、CCK-8试剂盒（G021-1-1）、Fe²⁺试剂盒（A039-1-1）、谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（A006-1-1）、丙二醛（MDA）检测试剂盒（A003-1-1）购自南京建成生物科技公司；SOX9（67439-1）、SLC7A11（26864-1）、GPX4（67763-1）、GAPDH（6000401）抗体、山羊抗兔IgG-HRP二抗（SA00001-2）购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 细胞培养

人正常卵巢上皮细胞系ISOE-80和五种卵巢癌细胞系（Hey、ES-2、CAOV3、SKOV3、A2780）在含有10%胎牛血清、1%链霉素-青霉素的DMEM培养基中培养。所有细胞置于37 ℃、5% CO2的恒温细胞培养箱中进行培养。

1.3 细胞系构建

取对数生长期的A2780和SKOV3细胞，以2×10⁵个/mL的密度接种于6孔板中培养，待细胞生长至60%~70%密度后更换无血清培养基，使用Lipofectamine 2000转染试剂（赛默飞世尔科技公司）按照说明书对各组细胞进行转染，72 h后收集细胞。shNC序列为5'-GCCA GATCTCGGCGAAGTAAA-3'；shSOX9序列为5'- GCCGAGGAAGAACTATGAACA-3'。

1.4 CCK-8实验

将A2780和SKOV3细胞以2×10⁴个/mL的密度接种于96孔板中，每孔2 000个细胞，细胞悬液量为100 μL。分别在0、24、48、72、96  h将培养基更换为100 μL 的CCK-8溶液（10 μL CCK-8试剂+90 μL培养基），在培养箱中孵育2 h后用酶标仪检测A450 nm值。

1.5 平板克隆形成实验

将A2780和SKOV3细胞以4×102个/mL的密度接种于12孔板中，每孔体积为1 mL，连续培养12 d。培养结束用多聚甲醛固定后取0.1%结晶紫溶液染色30 min。PBS洗涤3次后于光学显微镜（奥林巴斯）下拍照并计数。

1.6 细胞划痕实验

将A2780和SKOV3细胞以4×10⁵个/mL的密度接种于6孔板中，待细胞长满后使用1 mL移液枪头垂直于6孔板在细胞壁面进行划痕，使用完全培养基继续培养，分别于0 h和48 h在同一位置拍照并测量划痕的宽度，使用Image J软件计算划痕面积及迁移率。

1.7 Transwell实验

取稳定敲低细胞系以每孔4×10⁵个细胞接种于Transwell小室中，下室中加入500 μL完全培养基，培养24 h后弃去孔中培养液。PBS清洗后用多聚甲醛固定，晾干后加入结晶紫溶液染色15  min后再次清洗小室，晾干后置于显微镜下拍照。

1.8 Western blot实验

吸取培养皿中的培养基，PBS洗涤三次，加入RIPA裂解液冰浴30 min，BCA法测量蛋白质样品的浓度。每孔取25 μg蛋白质上样，通过10% SDS-PAGE电泳分离蛋白质并转移到PVDF膜上，在BSA中封闭2 h后用TBST洗涤3次，每次5 min。随后将条带放于对应的一抗（SLC7A11、GPX4和GAPDH；1 ∶ 1 000）中于4  ℃摇床过夜。次日回收一抗，TBST缓冲液漂洗3次，加入山羊抗兔IgG-HRP二抗（1 ∶ 30 000比例），室温下孵育1 h，漂洗3次后使用化学发光仪（伯乐）曝光成像。

1.9 RNA提取和qRT-PCR

按照总RNA提取试剂盒说明书提取RNA，随后使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。使用SYBR qPCR Mix试剂（碧云天）进行qPCR检测。各基因的引物如下：GAPDH正向引物：5'-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3'；反向引物：5'-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3'；SOX9正向引物：5'-AGCGCTACTATGAGATTCCAAGG-3'；反向引物：5'-TGTATGCCTCCAAATAGCCC-3'。

1.10 Fe²⁺、GSH和MDA检测

提取细胞蛋白后，严格按照Fe²⁺试剂盒、GSH试剂盒和MDA试剂盒说明书检测细胞内Fe²⁺、GSH和MDA的水平。

1.11 细胞C11 BODIPY 581/591染色

吸去各组细胞培养基，并用PBS清洗三次。随后使用DMSO溶解C11 BODIPY 581/591试剂盒（MedChemExpress）并将其配制成浓度为10 mM的储存液。随后按照1 ∶ 2 000比例将储存液配制成工作液并预热。加入工作液并避光孵育30 min后用PBS清洗三次。滴加Hoechst染核，室温避光孵育20~30 min后于共聚焦显微镜（奥林巴斯）下拍照。

1.12 生物信息学分析

在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中调取卵巢癌的426个肿瘤样本和88个正常卵巢样本的转录数据，用ggplot2 R包绘制表达箱形图，分析SOX9的表达变化。从人类蛋白组学数据库（Human Protein Atlas，HPA）提取SOX9在正常卵巢组织和卵巢癌组织中的表达情况。

1.13 染色质免疫共沉淀结合定量PCR（ChIP-qPCR）

收集卵巢癌细胞后离心并加入37%甲醛于室温下交联，摇床上孵育10 min，随后加入甘氨酸、核酸裂解液并置于冰上超声处理1 min，离心后将上清转移到离心管中。取适量上清液，加入SLC7A11一抗4 ℃下旋转孵育过夜，加入Protein A/G磁珠（碧云天）4 ℃下旋转孵育2 h。将得到的抗体-染色质复合物进行反向交联和DNA纯化步骤。随后将纯化后的DNA样本加入PCR管中，冰上静置后添加DNA、H₂O、PCR 和引物开始PCR反应程序。SLC7A11正向引物：5'-AAGTCGTGTGTGACAATGGC-3'；反向引物：5'-GTGCTAGTGAGTCCAATCTAGC-3'。

1.14 统计学分析

使用SPSS 25软件进行统计学分析，使用Graphad Prism 9.4.1软件作图。所有数据均以均数和标准差（）表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SOX9在卵巢组织中的表达

从TCGA和HPA数据库中提取卵巢癌组织和正常卵巢组织的数据进行比较，结果显示，相较于正常卵巢组织，SOX9在卵巢癌组织中的mRNA和蛋白表达量均显著增加（图1）。

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  图1 SOX9在卵巢组织中的表达

  Figure1.Expression of SOX9 in ovarian tissue

  注：A.TCGA数据库中卵巢癌组织和正常卵巢组织SOX9的表达水平；B.HPA数据库中卵巢癌组织和正常卵巢组织SOX9免疫组化数据；*P<0.05。

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2.2 SOX9敲低的SKOV3和A2780细胞系构建

通过qRT-PCR法检测SOX9在人正常卵巢上皮细胞ISOE-80和五种卵巢癌细胞系（Hey、ES-2、CAOV3、SKOV3、A2780）的mRNA表达情况。结果显示，SOX9在A2780和SKOV3细胞中表达显著增加（图2-A）。分别使用shNC和shSOX9转染SKOV3及A2780细胞，构建敲低SOX9的稳转细胞株。qRT-PCR及Western blot实验证实shSOX9显著降低了SOX9的mRNA和蛋白表达水平（图2-B至图2-D）。

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  图2 SOX9稳定敲低的SKOV3和A2780细胞系的构建

  Figure2.Construction of SKOV3 and A2780 cell lines stable knockdown SOX9

  注：A.qPCR检测SOX9在ISOE-80、Hey、ES-2、CAOV3、SKOV3和A2780细胞中的表达；B.qPCR验证SOX9敲低效果；C.Western blot验证SOX9在SKOV3细胞中的敲低效果；D.Western blot验证SOX9在A2780细胞中的敲低效果；*P<0.05；**P<0.01。

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2.3 SOX9对卵巢癌细胞增殖的影响

为了探究SOX9对卵巢癌细胞增殖能力的影响，使用CCK-8法和平板克隆形成实验检测细胞活力。如图3-A所示，与shNC组相比，敲低SOX9显著抑制了卵巢癌细胞系SKOV3和A2780的增殖能力。平板克隆形成实验结果表明，相较于对照组，SOX9敲低显著抑制了细胞集落的数量（图3-B）。

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  图3 SOX9对A2780和SKOV3细胞增殖能力的作用

  Figure3.The effects of SOX9 on the proliferation of A2780 and SKOV3

  注：A.CCK-8实验检测细胞增殖情况；B.平板克隆形成实验检测细胞增殖情况及定量分析；**P<0.01。

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2.4 SOX9对卵巢癌细胞迁移与侵袭的影 响

Transwell结果显示，敲低SOX9后，细胞侵袭的数量显著减少（图4-A）。细胞划痕实验结果显示，敲低SOX9后卵巢癌细胞迁移率受到显著抑制（图4-B）。

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  图4 SOX9敲低对A2780和SKOV3侵袭和迁移能力的影响

  Figure4.The effects of SOX9 on the migration of A2780 and SKOV3

  注：A.Transwell实验代表图像及定量分析；B.细胞划痕实验代表图像及定量分析；标尺.50 μm；**P<0.01。

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2.5 SOX9通过调控SLC7A11的转录激活铁死亡

为探究SOX9对卵巢癌细胞侵袭的影响是否与铁死亡有关，检测卵巢癌细胞内Fe²⁺、GSH和MDA的水平以及脂质过氧化水平。与对照组相比，敲低SOX9的卵巢癌细胞内Fe²⁺水平显著升高，GSH水平显著下降，MDA水平显著升高（图5）。敲低SOX9显著提高了细胞内脂质过氧化水平（图6）。与对照组相比，敲低SOX9的卵巢癌细胞内SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著降低（图7-A至图7-B）。此外，ChIP-qPCR结果显示SOX9在SLC7A11启动子区域显著富集（图7-C）。以上实验结果表明SOX9可能通过调控SLC7A11的转录激活铁死亡。

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  图5 SOX9对卵巢癌细胞内Fe2+、GSH和MDA水平的作用

  Figure5.The effects of SOX9 on the Fe2+、GSH and MDA in ovarian cancer cells

  注：A.卵巢癌细胞内Fe2+水平；B.卵巢癌细胞内GSH水平；C.卵巢癌细胞内MDA水平；**P<0.01。

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  图6 SOX9对卵巢癌细胞内脂质过氧化水平的作用

  Figure6.The effects of SOX9 on the lipid peroxidation in ovarian cancer cells

  注：A.共聚焦显微镜拍摄SKOV3细胞内脂质过氧化物水平及定量分析；B.共聚焦显微镜拍摄A2780细胞内脂质过氧化物水平及定量分析；标尺.50  μm；**P<0.01。

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  图7 SOX9对SLC7A11/GPX4通路蛋白水平的影响

  Figure7.The protein level of SLC7A11/GPX4 after the inhibition of SOX9

  注：A.Western blot检测干扰SOX9后SKOV3细胞SLC7A11和GPX4表达水平；B.Western blot检测干扰SOX9后A2780细胞SLC7A11和GPX4表达水平；C.ChIP-qPCR检测SOX9在SLC7A11启动子区域富集水平；**P<0.01。

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2.6 SOX9通过激活铁死亡抑制卵巢癌的进展

为证实SOX9是否通过激活铁死亡抑制卵巢癌的进展，使用Fer-1抑制细胞内铁死亡。与shNC组相比，敲低SOX9显著抑制了卵巢癌细胞系SKOV3，抑制铁死亡后其增殖能力增强（图8-A）。Transwell结果显示，敲低SOX9后，细胞侵袭数量显著减少，而抑制铁死亡后细胞侵袭数量增多（图8-B）。以上结果表明SOX9通过激活铁死亡抑制卵巢癌的进展。

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  图8 SOX9通过激活铁死亡抑制卵巢癌的进展

  Figure8.SOX9 inhibited the process of ovarian cancer through activating ferroptosis

  注：A.CCK-8实验检测SKOV3细胞增殖情况；B.Transwell实验检测SKOV3细胞侵袭能力；**与shNC组比较，P<0.01；#与shSOX9组比较，P<0.05；标尺.50 μm。

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3 讨论

本研究探讨了SOX9对卵巢癌铁死亡的影响及作用机制，结果发现SOX9在卵巢癌中表达显著增高，表明SOX9与卵巢癌的进展密切相关。为进一步探究SOX9在卵巢癌中的作用及机制，构建SOX9敲低细胞系，结果表明敲低SOX9后显著抑制了卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，SOX9通过结合SLC7A11启动子区域抑制SLC7A11的转录，进而抑制SLC7A11/GPX4通路并激活铁死亡。

转录因子通过与下游靶基因启动子区域结合调控靶基因表达，在卵巢癌、前列腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤的侵袭和转移中发挥了重要的作用 [14]。SOX9作为SOX家族中重要的转录因子之一，能通过激活下游不同靶基因参与肿瘤的进展，已成为肿瘤的诊断标志物[15]。Liu等[16]研究表明SOX9在乳腺癌CD8+ T细胞中表达显著增加，并通过转录调控STAT3激活B7-H4介导的免疫逃逸导致乳腺癌转移和复发。

铁死亡是一种铁依赖性细胞死亡方式，其核心特征是脂质过氧化物的异常积累导致细胞膜完整性破坏[17-18]。在肿瘤中，铁死亡具有双重作用：①可作为天然抗肿瘤机制，通过清除肿瘤细胞抑制肿瘤的进展；②肿瘤可通过代谢重编程抵抗铁死亡，导致肿瘤的转移和化疗耐药[19]。SLC7A11/ GPX4是调控铁死亡的关键通路之一，SLC7A11将细胞外的胱氨酸转运至胞内的同时将谷氨酸转运至细胞外。敲除SOX9后SLC7A11和GPX4的表达水平显著下降，同时细胞内Fe²⁺、MDA水平和细胞脂质过氧化水平显著升高，而GSH水平显著下降，表明敲低SOX9后铁死亡显著激活。有研究报道在卵巢癌中铁代谢异常显著，细胞内铁超载，从而增强脂质过氧化和铁死亡敏感性[20]，与本研究结果一致。为了进一步探究SOX9调控铁死亡的机制，本研究通过ChIP-qPCR实验证实了SOX9能够结合在SLC7A11启动子区域并调控其转录。以上结果表明，卵巢癌中SOX9通过调控SLC7A11的转录抑制SLC7A11/GPX4通路从而激活铁死亡。

本研究存在一定局限性。首先，需构建SOX9稳定过表达的细胞株进一步验证SOX9对卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移的影响。其次，本研究仅在细胞层面验证了靶向SOX9的作用，未来还需在动物实验中进一步验证。最后，SOX9是否通过调控其他铁死亡相关通路（如ACSL4），仍需进一步的实验去探究。

综上所述，本研究揭示了SOX9在卵巢癌中的作用及功能，敲低SOX9能通过抑制SLC7A11/ GPX4通路激活铁死亡，抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，为卵巢癌的治疗提供了一个新的靶点和方向。

伦理声明：不适用

作者贡献：研究设计：叶学均、王中显；实验操作：叶学均、李贵香；数据分析：王中显、程大玲；经费支持：陶杏元、王中显

数据获取：本研究中使用和（或）分析的数据可联系通信作者获取

利益冲突声明：无

致谢：不适用

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