目的  通过全蛋白质组孟德尔随机化（MR）方法评估血浆蛋白与不宁腿综合征（RLS）的因果关系，探索RLS治疗新靶点。

方法  从英国生物样本数据库获取血浆蛋白的全基因组关联分析（GWAS）数据，从FinnGen R11版本数据库提取RLS的GWAS数据，进行共定位分析以确定血浆蛋白和RLS之间共有的因果变异。

结果  MR分析显示，血浆蛋白ASPSCR1[OR=0.678，95%CI（0.544，0.847）]、C1QTNF5[OR=0.526，95%CI（0.367，0.752）]对RLS具有保护作用；血浆蛋白KRT19[OR=1.769，95%CI（1.283，2.439）]、LAT2[OR=5.536，95%CI（2.206，13.893）]与RLS发病风险升高相关。共定位分析发现4种血浆蛋白中，LAT2有强的因果变异关系，而ASPSCR1、C1QTNF5、KRT19有中等强度的因果变异关系。蛋白功能网络提示，与RLS相关的蛋白关联基因在糖跨膜转运蛋白活性、碳水化合物跨膜转运活性、Fc受体信号通路显著富集。

结论  本研究鉴定了4种血浆蛋白与RLS的因果关系，为RLS治疗提供了潜在的治疗靶点，但仍需进一步的研究加以证实。

不宁腿综合征（restless legs syndrome，RLS）是一种常见的主要累及腿部的中枢性感觉运动障碍性疾病，其典型临床表现为睡眠期间或睡前双下肢有不舒服的感觉及强烈移动腿的冲动，因此被归类为睡眠相关运动障碍[1]。欧美国家RLS的患病率为3.9%~14.3%[2]，亚洲人群发病率相对较低，为0.1%~3.0%[3]，上海部分农村成人患病率为1.39%[4]。RLS的治疗手段包括非药物（按摩或温浴）和药物治疗，一线药物治疗方案包括铁替代治疗，或者使用加巴喷丁-恩那卡比或普瑞巴林，以及多巴胺受体激动剂如普拉克索、罗匹尼罗和罗替戈汀等[5]。一项Meta分析结果显示，加巴喷丁-恩那卡比可能是治疗 RLS 最有效的药物，但易出现嗜睡和头晕等不良反应[6]。因此，为更好地提高患者的生活质量，寻求更有效的治疗策略至关重要。

血浆蛋白在多种生物过程中均发挥着至关重要的作用，如信号传导、运输、生长、修复和免疫防御等，血浆蛋白的失调已被证实参与多种疾病的发生发展，这使其成为药物研发的重要靶点 [7]。研究表明，铁调素作为一种血浆蛋白在RLS患者中异常升高，针对铁调素通路的干预，如靶向其调控分子或受体，是当前RLS新药研发的潜在策略[8]。基于血浆蛋白的功能特性，探索更多RLS治疗靶点，是开发新型治疗药物的重要研究方向。孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）分析是发现新的治疗靶点的新兴工具[9-10]，全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）可确定染色体上调节蛋白质表达的特定单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP），这些SNP是影响蛋白质丰度的数量性状位点（protein quantitative trait loci，pQTL）[11]。MR使用pQTL作为工具变量（instrumental variables，IVs），探索暴露与结果之间的潜在因果关系，可筛选药物靶点和生物标志物[12-13]，与观察性研究相比，MR有助于减少混杂因素的影响，从而增强因果关系的可靠性。本研究旨在应用GWAS数据和血浆的pQTL 数据通过MR方法探索RLS潜在药物靶点的血浆蛋白。

1 资料与方法

1.1 数据来源

血浆pQTL来自英国生物样本数据库（UK Biobank-ppp），该数据库包含了来自54 219名参与者的2 940种血浆蛋白的GWAS数据，涵盖了血浆中丰度较高、可稳定检测的大部分蛋白质，包括细胞因子、趋化因子、生长因子、激素、酶、受体、载脂蛋白、补体成分、组织渗漏蛋白等，涉及几乎所有生物学通路，是目前最大最全面的血浆蛋白质组数据库[14]。RLS的GWAS数据来自FinnGen R11数据库，包含欧洲3 198例RLS患者和408 983例对照。验证队列中RLS的GWAS数据来自国际EU-RLS-GENE联盟，包含7  248 例RLS患者、19 802例对照。研究样本均为欧洲血统人群，以避免因种族差异引起的偏差。

1.2 IVs 的筛选

本研究中血浆蛋白pQTL的IVs筛选条件如下：①cis-pQTL的阈值为基因区域上下游1 Mb范围内的SNP；②与血浆蛋白高度相关的SNP显著阈值为P＜5×10^-8；③去除连锁不平衡以保证IVs之间的独立性（r²＜0.001，kb=10 000）[15]；④F＞10，以排除弱IVs[16]。

1.3 统计学分析

1.3.1 MR分析

本研究采用两样本MR分析方法，血浆蛋白作为暴露因素，RLS作为结局，pQTL的筛选条件同上。研究使用 R 4.3.2软件进行数据处理和统计分析，并调用商业化 R 包 MendelR（版本 2.0，阈上医学科技有限公司）进行MR分析。采用逆方差加权法（inverse variance weighted，IVW）、MR-Egger回归、加权中位数法、加权众数法、Wald比值法（Wald ratio）等5种方法探索血浆蛋白和RLS之间的潜在因果关系。在分析过程中，当某血浆蛋白只有一个SNP时，应用Wald ratio法；有两个或两个以上SNP可用时，以IVW作为主要方法，其他方法用于对结果作进一步验证。当IVW结果显著，而其他方法结果不显著时，只要其他方法的β值与IVW方向一致，该结果仍可视为阳性结果[17]。考虑到重复计算，采用错误发现率（false discovery rate，FDR）方法进行P值校正，P_FDR＜0.1认为有统计学意义 [18]。应用Steiger滤波确认蛋白质与RLS之间是否存在反向因果关系。由于IVs数量有限，无法进行异质性检验分析（Cochran's Q检验）和水平多效性检验（MR-Egger截距检验），后续通过共定位分析实现敏感性分析。

1.3.2 混杂因素分析

使用Phenoscanner包[19]进行表型扫描，以去除血浆蛋白组中与RLS危险因素相关的SNP。考虑RLS相关危险因素包括糖尿病、慢性肾脏疾病、卒中、冠心病、缺铁及缺铁性贫血、帕金森病、周围神经病、偏头痛等。当一个SNP达到全基因组显著水平（P＜5×10^-8），并与RLS危险因素相关时，去除该SNP。

1.3.3 共定位分析

共定位分析可以判断两个性状是否在一个区域内具有相同的因果变异[20]，测试了五个假设：①H₀表示与任何性状都没有关联；②H₁表示与性状1相关，与性状2无关；③H₂表示与性状2相关，与性状1无关；④H₃通过两个独立的SNP与这两个性状相关；⑤H₄通过共享SNP与这两个性状关联。H₄较高的后验概率（posterior probability，PPH4）为显著的MR结果提供了证据。本研究中PPH₄＞0.75为高强度共定位证据[21]，0.5≤PPH₄≤0.75为中等强度共定位证据[22]。

1.3.4 RLS相关蛋白的功能和网络预测

使用GeneMANIA（http://www.genemania.org）预测与RLS相关基因的功能和网络，GeneMANIA网站的具体设置如下：对于蛋白质网络的构建，选择physical interactions、predicting、genetic interactions、pathway、co- localization、shared protein domains六种类型。在自定义高级选项中，将最大结果基因参数设置为20，将最大结果属性设置为10，查询关联权重选择自动选择加权方法。以FDR＜0.05，功能通路的富集具有统计学意义。

1.3.5 外部验证

为证明MR结果的稳健性，使用来自国际EU-RLS-GENE联盟的RLS的GWAS数据进行验证，该数据包含RLS患者7 248例、对照19 802例。参数和方法与开发队列完全相同。以验证队列和开发队列分析结果中的比值比（odds ratio，OR）一致为验证成功。

2 结果

2.1 工具变量

根据筛选标准，共纳入1 530种血浆蛋白进行MR分析，IVs的F值范围为13.15~28  003.76，相关的SNP信息见附件表1。

2.2 MR分析结果

MR分析结果显示，ASPSCR1、C1QTNF5、KRT19、LAT2 4种血浆蛋白与RLS的发病风险相关（P_FDR＜0.1），详见附件表2。其中血浆蛋白ASPSCR1[OR=0.678，95%CI（0.544，0.847）]和C1QTNF5[OR=0.526，95%CI（0.367，0.752）]对RLS具有保护作用；血浆蛋白KRT19[OR=1.769，95%CI（1.283，2.439）]、LAT2[OR=5.536，95%CI（2.206，13.893）]与RLS发病风险升高相关（表1）。Steiger 方向性滤波检验证实，上述所有关联的因果方向均是从蛋白质到RLS（Steiger P 值均＜0.05），排除了反向因果关系的可能性（附件表3）。

2.3 混杂因素分析结果

Phenoscanner表型扫描结果显示，ASPSCR1（rs8074498）、C1QTNF5（rs2509656）、KRT19（rs1823996）、LAT2（rs34200032）与预设的糖尿病、慢性肾脏疾病、卒中等八个危险因素均不存在明显关联。

2.4 共定位分析结果

对4种血浆蛋白，在各自基因的上游和下游 ±1 MB范围内进行基因共定位分析，以探索与RLS的潜在关联。结果表明，LAT2在该区域有强的共同因果变异关系（PPH4＞0.75），而ASPSCR1、C1QTNF5、KRT19有中等的因果变异关系（0.5≤PPH4≤0.75），详见表1、附件图1、附件表4。

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  表格1 MR分析阳性结果及共定位分析结果

  Table1.Positive results of MR analysis and colocalization analysis results

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2.5 RLS相关蛋白的功能网络预测

与RLS相关的蛋白关联基因在各种功能通路中都有显著的富集（图1、附件表5），包括糖跨膜转运蛋白活性、碳水化合物跨膜转运活性、Fc受体信号通路。

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  图1 RLS相关蛋白功能网络

  Figure1.Functional network of RLS-related proteins

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2.6 外部验证

使用来自国际EU-RLS-GENE联盟RLS的GWAS数据作为结局，与UKB-PPP数据库血浆蛋白进行两样本MR分析进行重复验证，结果显示，ASPSCR1、C1QTNF5、KRT19、LAT2在验证队列中与RLS的相关性并未达到显著阈值，但OR值方向与开发队列一致，详见图2、附件表6。

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  图2 验证队列MR分析森林图

  Figure2.Forest plot of MR analysis of validation cohort

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3 讨论

本研究为探索血浆蛋白与RLS发病风险的因果关系，结合血浆蛋白的pQTL数据和RLS的GWAS数据进行MR分析。使用MR设计减少潜在的混杂因素和反向因果关系的偏倚，并纳入cis-pQTL以提高证据水平（cis-pQTL＞trans- pQTL＞eQTL），通过基因共定位分析以提高统计有效性，并使用EU-RLS-GENE联盟RLS的GWAS数据作为结局进行重复验证，从而提高研究结果的可信度，最后构建蛋白互作网络对血浆蛋白与RLS的潜在机制进行探讨。本研究显示血浆蛋白ASPSCR1、C1QTNF5对RLS具有保护作用；KRT19、LAT2与RLS发病风险升高相关。

ASPSCR1是一种与葡萄糖转运蛋白4相互作用的蛋白，其基因编码的蛋白质含有一个蛋白质结构域，主要在低胰岛素状态下发挥作用。该蛋白质与细胞内的葡萄糖转运和代谢相关，对细胞的葡萄糖摄取和利用有重要影响，在葡萄糖稳态和代谢疾病的研究中扮演着重要角色[23]。Bogan等 [24]研究显示该蛋白的变异可能增加患2型糖尿病的风险。高水平ASPSCR1可能增强葡萄糖转运效率，维持神经元和肌肉细胞的能量供应。RLS常与糖尿病共病，ASPSCR1水平升高可能通过优化葡萄糖利用，减少神经元损伤或功能障碍，进而降低RLS发病风险。C1QTNF5是一种分泌型蛋白，属于C1q/TNF相关蛋白（CTRP）家族。C1QTNF5通过结合AdipoR1和AdipoR2受体，激活AMPK信号通路，促进葡萄糖摄取和利用，改善胰岛素抵抗。此外，C1QTNF5还可以上调葡萄糖转运蛋白4的表达，增强葡萄糖向肌肉组织的转运，表明C1QTNF5在调节葡萄糖代谢、改善胰岛素抵抗方面发挥着重要作用[25]。高水平C1QTNF5可增强肌肉组织的葡萄糖转运和代谢效率，防止细胞能量危机。本研究中，蛋白互作网络显示ASPSCR1和C1QTNF5在糖跨膜转运蛋白活性、碳水化合物跨膜转运活性通路中显著富集，高血糖水平可能通过周围神经损伤[26]、慢性炎症对铁吸收和利用的干扰 [27]，以及间接影响多巴胺系统的功能等机制[28]，参与RLS的发病过程。由此推测，ASPSCR1和C1QTNF5对RLS具有保护作用可能源于糖代谢通路的整体优化。

KRT19是细胞中间纤维蛋白的一种，参与构建细胞骨架，维持细胞的形态和结构完整性。可与其他角质蛋白形成复合物，提供机械支撑，使细胞能够承受外界压力和应力。在细胞分化过程中，KRT19的表达模式会发生变化，参与调控细胞分化相关基因的表达，这在上皮组织发育和再生过程中起重要作用[29]。KRT19常被用作上皮来源肿瘤的生物标志物。在多种上皮性肿瘤如乳腺癌、肺癌、肝癌中，KRT19表达水平显著升高，可用于肿瘤的早期诊断和预后评估[30]。KRT19参与维持细胞机械支撑力，其异常高表达可能促进组织纤维化，对周围神经造成物理性压迫，并可能通过促炎因子（IL-6、TNF-α）释放，诱发神经炎症，破坏铁稳态，抑制多巴胺能神经元功能，参与RLS的病理过程[31]。

LAT2是一种膜蛋白，主要表达于免疫细胞如T细胞、B细胞等中，在免疫应答过程中发挥重要作用。LAT2可以与多种信号分子如磷脂酶Cγ1、Grb2等结合，激活下游的MAPK和Ca2+信号通路，促进T细胞的增殖和分化。LAT2可以与Syk、PLCγ2等分子相互作用，参与调节B细胞的增殖、分化和抗体产生[32]。另外，LAT2能够通过与FcεRI受体结合,激活肥大细胞，促进炎症因子的释放[33]。总之，LAT2作为一个关键的适配器蛋白，通过整合和传递细胞表面受体信号，在免疫细胞的活化、分化和炎症反应中发挥重要作用。近年来，LAT2在自身免疫疾病、肿瘤免疫等方面的研究也引起了广泛关注。本研究共定位分析显示，LAT2与RLS表现出较强的因果变异关系。多项研究显示，RLS患者肿瘤发病率约为10%~15%，高于普通人群[34]，尤其是肺癌、乳腺癌和前列腺癌[35]。RLS可能与多巴胺、铁、乙酰胆碱等神经递质失衡有关，而这些神经递质也参与肿瘤的发生发展[36]。另外，LAT2驱动T细胞增殖分化，其升高可能打破免疫耐受，导致自身抗体靶向攻击中脑多巴胺受体或铁转运蛋白，干扰多巴胺信号传导或铁摄取，诱发运动觉异常[37]。基于以上分析，推测KRT19、LAT2可能是RLS潜在的药物治疗靶点，但仍需通过细胞或动物模型进一步验证。

Qian等[38]研究基于deCODE数据库的RLS GWAS数据，鉴定出MAN1A2基因编码的蛋白质是RLS的潜在保护性靶点，与本研究结果存在差异，原因可能包括：首先，两项研究使用了不同的RLS GWAS数据源，其样本构成、表型定义和统计效能存在差异；其次，本研究采用了更为严格的IVs筛选标准（如LD：r²＜0.001）和相对宽松的探索性显著性阈值（P_FDR＜0.1），而Qian等的研究则使用了不同的标准（LD：r²＜0.1，P_ FDR＜0.05），导致最终纳入分析的IVs和阳性结果集合不同；此外，两项研究的验证策略各异，本研究采用外部样本队列（EU-RLS-GENE）进行验证，而Qian等的研究则侧重于通过共定位、SMR等多项内部分析深度验证MAN1A2的可靠性。这些方法学上的异质性表明，RLS的遗传和蛋白质组学基础可能非常复杂，不同研究从不同角度揭示了其潜在机制。未来仍需更大样本的多中心研究和功能实验来共同验证这些靶点的有效性及其在RLS病理生理中的具体角色。

综上，本研究发现ASPSCR1、C1QTNF5、KRT19、LAT2 4种血浆蛋白与RLS存在因果关系，可能是RLS治疗的新靶点，未来仍需进一步的研究加以证实。

附件见《医学新知》官网附录（https://yxxz.whuznhmedj.com/futureApi/storage/appendix/202411241.xlsx）

伦理声明：不适用

作者贡献：研究设计与论文撰写：张沁丽；研究实施：张沁丽、许华、韩秀燕；数据分析：张沁丽、许华；论文审定：刘红

数据获取：本研究使用的UK Biobank-ppp数据可在PMID: 37794186文献的数据链接（https://www.synapse.org/#!Synapse:syn51364943/files/）中获取，RLS的GWAS数据来自FinnGen R11数据库（https://www.finngen.fi/），国际EU-RLS-GENE联盟中RLS的GWAS数据可从IEU OpenGWAS project（https://gwas.mrcieu.ac.uk/）网站获取

利益冲突声明：本研究所用 MendelR 软件为商业软件，经授权使用，作者声明与阈上医学科技有限公司无任何利益冲突

致谢：不适用

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