妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus， GDM）是一种常见的孕期代谢紊乱，其发病率呈上升趋势[1]。GDM不仅影响孕妇和胎儿的近期健康，也可能增加子代未来罹患代谢性疾病的风险[2-4]。GDM的确切发病机制尚不明确，遗传因素、环境因素以及两者交互作用都与GDM的发生有关[5-6]。有证据显示，免疫功能失调也可能是GDM发生的重要因素之一[7]。正常妊娠过程中母体免疫系统需进行适应性调节以维持母胎耐受[8-9]，若该过程失衡，免疫细胞功能异常可能参与糖代谢紊乱和胰岛素抵抗的形成，进一步引发GDM[10]。GDM患者中多种免疫细胞（如T细胞、B细胞、巨噬细胞和NK细胞）存在激活状态异常，伴随炎症因子（如TNF-α、IL-6）水平升高，这可能通过破坏胰岛功能、调节糖代谢等机制影响GDM的发生[11-12]。此外，单核细胞的激活也与胰岛素敏感性下降密切相关[13]，提示免疫功能紊乱可能是GDM发病机制中的重要一环。总体来说，妊娠期免疫微环境的细微变化可能会影响糖代谢的敏感性并诱发GDM。明确妊娠期不同免疫细胞群体与糖尿病发生风险之间的关联，有助于开发新的预测模型，探索发现靶向免疫治疗方法[14]。尽管已有研究探讨了免疫功能的改变与GDM的关联，但尚无具体免疫细胞表型与GDM风险之间的因果关系的系统性分析。因此，本研究拟采用孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）方法，评估不同免疫细胞表型与GDM发生风险之间的关系，以期为GDM的免疫机制提供全新视角，并为临床实践提供理论指导。
1 资料与方法
1.1 研究设计
本研究基于两样本MR分析，评估免疫细胞特征与GDM之间的因果关系。MR使用遗传变异来表示风险因素，有效工具变量（instrumental variables，IVs）必须满足三个关键假设[15-16]：①IVs与暴露因素需存在稳定且强烈的统计学关联；②IVs不应受到暴露因素与结局变量之间其他混杂变量的影响；③IVs对结局变量的影响应仅通过暴露因素发挥作用。
1.2 数据来源
每个免疫特征的总全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）数据可从GWAS目录中公开获得（注册号为GCST90001391至GCST90002121）。共有731种免疫表型，包括绝对细胞计数（absolute cell count，AC）（n=118）、反映表面抗原水平的中值荧光强度（median fluorescence intensity，MFI）（n=389）、形态参数（morphological parameters，MP）（n=32）、相对细胞计数（relative cell count，RC）（n=192） [17]。具体而言，MFI、AC和RC特征包含B细胞、传统树突状细胞（conventional dendritic cells，cDC）、成熟T细胞、单核细胞、骨髓细胞、TBNK细胞（T细胞、B细胞、自然杀伤细胞）和调节性T细胞（regulatory T cells，Treg），而MP特征包含cDC和TBNK细胞。用于免疫细胞特征的GWAS研究基于3 757名欧洲血缘参与者的外周血样本数据，所分析的731种免疫细胞表型涵盖了多种免疫细胞亚群的数量、比例及其表面标志表达等表型特征。基因型数据基于高密度阵列平台，通过使用撒丁岛人群的参考基因组进行序列比对、扩展及调整协变量（包括性别、年龄及其平方项）后，最终获得约2 200万个单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）位点 [18]。GDM的数据来源于芬兰数据库（https://www.finngen.fi/），该数据共涉及5 687名GDM患者及117 892名健康人群作为对照组。
1.3 工具变量的选择
为获得较多免疫细胞表型的IVs，本研究采用较为宽松的阈值（P＜5×10-6）。为获得独立位点的IVs，本研究使用TwoSampleMR数据包数据，其连接不平衡阈值设置为R2＜0.001，聚合距离为10 000 kb，并排除F值小于10的弱IVs[19]。在反向MR分析中，GDM作为暴露时，本研究将显著性水平调整为5×10-8，其余操作未发生改变。
1.4 统计学分析
本研究以逆方差加权法（inverse variance weighted，IVW）作为主要分析方法 [20]，同时采用加权中位数法（weighted median estimator，WME）、MR-Egger回归法、简单模式法（simple mode，SM）及加权众数法（weighted mode，WM）进行补充验证[21]。在分析过程中，当IVW结果具有统计学意义（P＜0.05）时，若其他方法结果虽未达到显著性水平但其效应方向与IVW一致，该结果仍被视为可靠。为控制多重比较带来的假阳性，采用Benjamini-Hochberg方法对P值进行假发现率（false discovery rate，FDR）校正。IV的异质性通过Cochran's Q检验进行评估，若P ＞0.05则采用固定效应IVW模型，若P＜0.05则采用随机效应IVW模型[22]。通过MR-Egger回归的截距项检验水平多效性，若截距项P＜0.05则认为存在显著的多效性[23]。当检测到多效性时，采用MR-PRESSO方法识别并剔除异常SNP后重新分析。此外，通过留一法敏感性分析评估单个SNP对整体结果的影响。所有分析均使用R 4.3.1软件及TwoSampleMR包完 成。
2 结果
2.1 工具变量
根据筛选标准（P＜5×10-6）筛选与免疫细胞显著相关且彼此独立的SNPs作为正向MR分析的IV，选择与GDM显著相关（P＜5×10-8）且彼此独立的SNPs作为反向MR分析的IV，所有IV的F值＞10，表明弱IV偏倚的可能性较小，结果可靠性增大。
2.2 免疫表型与GDM风险的因果关系
2.2.1 MR分析
当以免疫表型为暴露因素，GDM为结局因素时，在0.05的显著性水平上，共鉴定出40种免疫表型与GDM的发展有因果关系。B细胞组13种，髓细胞组2种，成熟的T细胞组2种，TBNK细胞组8种，Treg细胞组6种，cDC细胞组6种，单核细胞组3例（表1）。
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表格1 正向MR分析结果
Table1.Forward MR analysis results
在B细胞组中，CD20- CD38- %B cell 、CD20- CD38- %lymphocyte、CD19 on IgD+ CD24-、CD19 on IgD+ CD38-、CD19 on PB/PC、CD19 on sw mem、CD19 on IgD+、CD20 on IgD+ CD24-、CD20 on IgD- CD24-、CD20 on IgD+与GDM风险呈负相关，而IgD- CD38dim %B cell、IgD+ CD38dim %lymphocyte、CD38 on IgD+ CD38br与GDM风险呈正相关（表1）。
在髓细胞组中，CD45 on Gr MDSC、HLA DR on CD33- HLA DR+与GDM风险呈正相关（表1）。
在成熟的T细胞组中，HVEM on EM CD8br、HVEM on CD4+与GDM风险呈正相关（表1）。
在TBNK细胞组中，CD4+ CD8dim AC、CD45 on CD4+与GDM风险呈负相关，而HLA DR++ monocyte %leukocyte，DN (CD4-CD8-) AC、T cell %leukocyte、B cell AC、CD3 on NKT、SSC-A on myeloid DC与GDM风险呈正相关（表1）。
在Treg细胞组中，Activated & resting Treg %CD4+与GDM风险呈负相关，而CD3 on CD4+、CD4 on CD4 Treg、CD4 on resting Treg、CD4 on CD39+ activated Treg、CD4 on activated & secreting Treg与GDM风险呈正相关（表1）。
在cDC细胞组中，CCR2 on granulocyte与GDM风险呈负相关，而CD62L- plasmacytoid DC AC、SSC-A on HLA DR+T cell、HLA DR on myeloid DC、HLA DR on plasmacytoid DC、HLA DR on DC与GDM风险呈正相关（表1）。
在单核细胞组中，HLA DR on CD14+ CD16- monocyte、HLA DR on CD14+ monocyte、HLA DR on monocyte与GDM风险呈正相关。
FDR矫正后的结果及五种统计方法显示HLA DR on CD33- HLA DR+及HLA DR on DC仍然具有统计学意义（表1、表2），余四种方法的结果可见附件表1。
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表格2 HLA DR on CD33- HLA DR+和HLA DR on DC对GDM的MR分析结果
Table2.Mendelian randomization results for GDM for HLA DR on CD33- HLA DR+ and HLA DR on DC
2.2.2 敏感性分析
Cochran's Q检验结果显示，CD20- CD38- %B cell、IgD- CD38dim %B cell存在异质性（P＜ 0.05），对于此两种免疫细胞表型，选择IVW方法的随机效应模型进行分析，其余免疫细胞表型未见明显异质性，采用IVW方法中的固定效应模型分析。IVW 的漏斗图结果显示，蓝色分界线两侧散点分布虽不均匀，但Cochran's Q检验未见异质性（附件图1）。在MR-Egger检验中，所有免疫细胞的多效性检验P值均大于0.05，异质性、多效性检验详细结果可见附件表2。使用留一法对结果进行敏感性分析，结果证明了所观察的因果关系较为稳健（附件图2）。
2.3 GDM与免疫表型的因果关系
当以GDM为暴露因素，免疫表型为结局因素时，以IVW法为主要分析方法，其他方法为辅助，结果显示，GDM与上述40种免疫表型均无因果关系，见附件表3。余四种方法的结果可见附件表4。
3 讨论
本研究发现B细胞群体中多个表型与GDM呈负向关联。如CD20- CD38- %B cell与GDM负相关，与B细胞在调节孕期免疫耐受方面的重要作用相吻合[24]。研究表明，B细胞可以分泌IL-10等抗炎因子，抑制过度的炎症反应[25]。此外，B细胞还可以通过诱导Treg细胞的产生来维持妊娠期免疫平衡 [26]。推测B细胞群体中特定表型可能通过上述途径影响妊娠期炎症状态，从而对妊娠期糖代谢产生保护作用，抑制GDM的发生。这为开发以B细胞为靶点的新型预防方案提供了理论依据。
其次，本研究发现TBNK细胞、Treg细胞、单核细胞等多个组别中也存在与GDM正相关的表型。Treg细胞的失调可能通过促进炎症反应增加胰岛素抵抗的风险。本研究结果显示Activated & resting Treg %CD4+增加与GDM 风险降低相关，提示总体Treg比例升高可能具有保护作用，这与以往研究结果一致[27]；而多种Treg亚群上CD4分子表达增强（包括静息 Treg、CD39+活化 Treg 及活化并分泌型 Treg）均与 GDM 风险升高相关，这种双向模式表明：虽然Treg总体扩增有助于维持母胎免疫耐受，降低 GDM 风险，但 Treg出现异常活化或功能性偏移时，可能通过促进炎症反应反而增加胰岛素抵抗的风险[28-29]。本研究还发现单核细胞群体的表型与GDM正相关，表明单核细胞在慢性低度炎症反应中可能发挥了重要作用。单核细胞通过分泌促炎因子加剧炎症反应，进而影响胰岛素敏感性，提示GDM与慢性低度炎症状态相关[30]。研究表明，妊娠期炎症因子水平升高会导致胰岛素信号传导异常，进而诱发胰岛素抵抗[31]。与本研究的研究结果一致，即GDM患者体内可能存在免疫激活失调，导致异常炎症反应，继而影响糖代谢过程。
本研究发现经过FDR矫正后，HLA-DR on CD33- HLA-DR+、HLA-DR on DC与GDM仍然存在显著的正向因果关联，提示其在GDM的发生发展中可能发挥重要作用。HLA-DR作为主要组织相容性复合体II类分子，其在抗原呈递和免疫激活中的核心地位已被广泛认可[32-33]。CD33- HLA-DR+细胞主要代表非髓系来源的抗原呈递细胞，可能包括某些活化的树突状细胞（dendritic cell，DC）亚群，其高表达的HLA-DR反映出免疫系统的活跃状态[34]。免疫系统的异常激活，特别是抗原呈递细胞的功能失调，可能促进慢性炎症反应，干扰胰岛素信号通路，进而增加GDM的发病风险。同时，DC作为关键的免疫调节细胞，其成熟状态和功能由HLA-DR表达水平体现。在健康妊娠过程中，DC通常处于较为耐受的状态以维持胎儿免疫耐受[35]。然而，在GDM患者中，DC的HLA-DR表达显著升高，提示其免疫活化增强，可能促进炎症介质的释放，加剧代谢紊乱[36]。已有研究指出，GDM相关的系统性炎症状态与DC活化密切相关，可能是连接妊娠期免疫微环境改变与糖代谢异常的重要桥 梁[37]。
本研究中反向MR分析并未发现GDM与这些免疫表型存在因果关系，表明虽然免疫功能失调与GDM相关，但后者本身可能不会直接改变免疫细胞表型。因此，本研究推测这些免疫细胞变化更可能是妊娠期体内环境改变(如激素、营养状态改变等)对免疫系统的影响，而非GDM的直接结果。这一发现为本研究提供了重要的临床启示，在防治GDM时，应关注优化孕期营养状态、减轻孕期应激等综合临床措施，这可能对稳定孕期免疫功能更为重要[38]。
尽管本研究与Ji等[39]研究框架较为相似，但该文章采用的免疫细胞暴露阈值为1×10-5，本研究采用的阈值为5×10-6，故最终的结果或有不同，该文仅讨论部分FDR小于0.05的免疫细胞表型，本文更注重免疫细胞的分类，讨论的内容更为详 细。本研究也存在一定的局限性。首先，样本多为欧洲人群，结果的普适性有待进一步验证；其次，本研究为观察性研究，难以完全排除混杂因素，且机制层面仍需进一步的分子生物学研究加以证实。未来将开展多中心、前瞻性队列研究，结合多学科方法深入探讨免疫表型与GDM的关联，为临床实践提供更有力的证据支持。
综上所述，本研究揭示了免疫功能在GDM发病机制中的复杂作用， HLA DR on CD33- HLA DR+、HLA DR on DC可能是GDM发病的潜在风险因素。随着相关机制的进一步阐明，基于调节免疫功能的新型综合临床模式将为减轻GDM对母婴健康的危害提供新的手段。
附件见《医学新知》官网附录（https://yxxz.whuznhmedj.com/futureApi/storage/appendix/202410144.docx）
伦理声明：不适用
作者贡献：数据整理与分析、论文撰写：汪娟；数据分析与结果验证：王琼、林星光、叶晓荷；论文审定：申利
数据获取：本研究中使用和（或）分析的数据可联系通信作者获取
利益冲突声明：无
致谢：不适用
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