非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是不饮酒或极少饮酒者肝脏脂肪长期积累而形成的一种慢性肝病，临床表现为脂肪变性、血脂异常[1]。NAFLD患者病情中后期会发展为非酒精性肝炎和肝硬化，大大增加了患肝癌的风险。脂肪堆积引起的脂肪变性或过度脂肪酸氧化会打破细胞内的代谢平衡，引发线粒体破坏和大量活性氧的产生，导致氧化应激并激活炎症因子，最终通过诱导肝细胞凋亡等途径加重局部炎症，导致NAFLD的发生[2]。目前尚无治疗NAFLD的特效药物，联合用药治疗是最常用的方法，虽起到一定的疗效，但长期服用会对肝和肾等器官产生毒性作用，影响机体代谢功能 [3]。因此寻求无毒且高效的药物是应对NAFLD晚期恶化、减少肝移植的重要举措。积雪草苷（asiaticoside，ASI）已被发现在抗氧化、抑制细胞凋亡和减轻脑缺血导致的认知障碍等方面发挥重要作用[4-5]，并且可以通过调节Notch信号通路抑制肝星状细胞的活化进而阻断肝纤维化的进展，减轻肝损伤 [6]。既往研究发现患有严重NAFLD患者的肝脏中许多微小RNA（miRNAs）表达失调，其中miR-29b-3p在代谢性疾病、胰岛素抵抗和Ⅱ型糖尿病的各种组织和细胞中显著增加[7-8]。本研究使用ENCORI数据库预测miR-29b-3p可能与叉头框蛋白O3（forkhead box O3，FoxO3）存在互补结合位点。研究表明FoxO3对甘油三酯的合成以及肝脏脂代谢具有一定的调节作用，提示FoxO3可能与NAFLD密切相关[9]。杨仁国等 [10]指出下调miR-29b-3p通过靶向上调FoxO3可调节脂代谢、减轻炎症和氧化应激反应。因此miR- 29b- 3p/ FoxO3轴可能成为治疗NAFLD的重要调控通路。目前，尚无ASI通过调控miR- 29b-3p/FoxO3轴调节脂代谢的研究。本研究通过构建NAFLD模型大鼠，旨在探究ASI对NAFLD大鼠肝损伤及miR-29b-3p/ FoxO3通路的影响，以期为治疗NAFLD提供可靠的理论基 础。
1 材料与方法
1.1 实验动物
10周龄雄性Wistar大鼠（260~300 g）购自中国科学院[许可证号：SCXK（京）2021-0012]。大鼠单独饲养于通风鼠笼中（湿度60%±5%，温度22±2 ℃，12 h明暗循环）。向所有大鼠提供基础日粮，自由饮水和活动。实验前进行7 d的适应性饲养。本研究经武汉市第三医院实验动物伦理委员会审核批准（批号：武三医实伦SY2022-054）。
1.2 药品与试剂
ASI（CAS号：125265-68-1，纯度：≥98%）购自湖北萃园生物科技有限公司；反转录试剂购自Takara公司；HE染色试剂盒（货号：LZ-01X9135）购自上海联祖生物科技有限公司；丙二醛（MDA，货号：5989）、超氧化物歧化酶（SOD，货号：5966）、过氧化氢酶（CAT，货号：5776）ELISA试剂盒购自上海研生实业有限公司；兔抗FoxO3单克隆抗体（货号：AF609）、兔抗Bcl-2多克隆抗体（货号：AB112）、兔抗Caspase 3多克隆抗体（货号：AC030）、兔抗β-actin多克隆抗体（货号：AF5003）购自上海碧云天生物技术有限公司；引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成；miR-29b-3p过表达及阴性对照质粒由和元生物技术（上海）股份有限公司合成。
1.3 实验方法
1.3.1 动物造模
经过7 d的适应性喂养后，参考相关文献[11]建立NAFLD模型大鼠。高脂饲粮（65.55%基础日粮、20.00%猪油、10.00%蔗糖、4.00%胆固醇、0.25%胆酸盐、0.20%甲基硫脲嘧啶）持续饲喂5周。大鼠出现体重增加、肝指数上升、肝组织发生病理变化、血清脂质代谢指标异常，则视为造模成 功[12]。
1.3.2 分组及给药
将72只大鼠随机分为6组，每组12只。① 对照组（Control），喂食基础日粮、灌胃生理盐水；②模型组（Model），构建NAFLD模型、灌胃生理盐水；③ASI低剂量组（ASI-L），构建NAFLD模型、灌胃15 mg/kg的ASI；④ASI高剂量组（ASI-H），构建NAFLD模型、灌胃30 mg/kg的ASI；⑤高剂量ASI+空白质粒组（ASI-H+Vector），构建NAFLD模型、灌胃30 mg/kg的ASI，尾静脉注射100 μL 空白质粒；⑥高剂量ASI+miR-29b- 3p过表达质粒组（ASI- H+OV-miR-29b-3p），构建NAFLD模型、灌胃30 mg/ kg的ASI，尾静脉注射100 μL miR- 29b-3p过表达质粒。ASI和生理盐水的灌胃剂量参考相关文献[13]，每日一次；质粒每3 d注射一次，连续4周。
1.4 指标检测及方法
1.4.1 肝指数检测
取样前一天对所有大鼠禁食不禁水，采样当天对各组大鼠称重并进行腹主动脉取血；安乐死后分离大鼠肝脏并称重。肝脏指数表示为肝脏质量占体重的百分比。
1.4.2 血清炎症细胞因子和氧化应激水平检测
对大鼠进行腹主动脉采血，离心取上清。一部分使用Selectra ProM全自动生化分析仪检测胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、谷草转氨酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平。另取部分血清，先按照ELISA试剂盒的说明稀释标准液，经加样、孵育、洗涤，加生物素化检测抗体、孵育、洗涤，加HRP标记亲和素、孵育、洗涤，显色、终止反应后于酶标仪上读数。根据标准曲线计算MDA、SOD、CAT、TNF-α、IL-6水平。
1.4.3 HE染色
取大鼠肝脏组织，一部分在10%福尔马林溶液中固定24 h，乙醇梯度脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，在光学显微镜下观察肝组织形态；另一部分组织于-80 ℃下冷冻保存。
1.4.4 RT-qPCR
取冻存肝组织（每组6只），Trizol法提取总RNA并测定浓度，定量后分别进行RNA的反转录和实时荧光定量PCR反应。通过熔融曲线图确认引物是否特异。使用2-∆∆CT方法计算目的基因的相对表达水平。miR-29b-3pd的上游引物：5'-AGTTGGGTGGAGGCTCTCC-3'，下游引物：5'-GCGACGAGCAAAAAGCTTGT-3'；FoxO3的上游引物：5'-ATGGCAGAGGCACCAGCC-3'，下游引物：5'-CAAAGCTGGCTACCAGGCTGA-3'；GAPDH的上游引物：5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，下游引物：5'-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3'。
1.4.5 Western blot
取冻存肝组织（每组6只），加入蛋白裂解液充分反应，提取并定量总蛋白（BCA法）。蛋白经变性、SDS-PAGE电泳分离、转膜、封闭后，膜分别与FoxO3（1 ∶ 1 000）、Bcl-2（1 ∶ 500）、Caspase 3（1 ∶ 1 000）、β-actin（1 ∶ 1 000）一抗在4℃下孵育过夜，TBST洗膜后添加HRP标记的山羊抗兔二抗IgG（1 ∶ 1 000），室温孵育1 h。可视化处理后Image J软件进行灰度分析。
1.4.6 miR-29b-3p和FoxO3靶向关系验证
ENCORI数据库预测miR-29b-3p和FoxO3之间存在的结合位点，分别构建野生型质粒FoxO3-WT和突变型质粒FoxO3-MUT，将OV- miR-29b-3p、miR-NC分别与构建的野生型或突变型质粒共转染到人胚肾细胞HEK293T（货号：62494，诺安基因科技有限公司）中培养48 h，检测荧光酶活性。
1.5 统计学分析
使用SPSS 24.0软件对实验数据进行统计学分析，并用GraphPad Prism 9软件绘制相关图片。经Shapiro-Wilk检验，计量资料均符合正态分布，以均数和标准差（
）表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠肝指数变化
相较于Control组，Model组大鼠肝质量和肝指数显著升高（P＜0.05）；相较于Model组，ASI-L组、ASI-H组大鼠肝质量和肝指数显著降低（P＜0.05）；相较于ASI-H+Vector组，ASI-H+OV-miR-29b-3p组大鼠肝质量和肝指数显著升高（P＜0.05），见图1。
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图1 各组大鼠肝质量及肝指数比较（n=12）
Figure1.Comparison of liver weight and liver index in different groups of rats (n=12)
注：A.各组大鼠肝质量比较；B.各组大鼠肝指数比较；a与Control组比较，P＜0.05；b与Model组比较，P＜0.05；c与ASI-L组比较，P＜0.05；d与ASI-H+Vector组比较，P＜0.05。
2.2 大鼠血清生化指标水平变化
相较于Control组，Model组大鼠脂代谢指标（TC、TG）水平和反映肝实质损害指标（AST、ALT）均明显升高（P＜0.05）；相较于Model组，ASI-L组、ASI-H组大鼠TC、TG水平和AST、ALT水平均显著降低，且随着ASI剂量增加，下降幅度加大（P＜0.05）；相较于ASI-H+Vector组，ASI- H+OV-miR-29b-3p组大鼠血清中以上各指标均显著升高（P＜0.05），见图2。
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图2 各组大鼠血清生化指标水平比较（n=12）
Figure2.Comparison of serum biochemical indexes in different groups of rats (n=12)
注：A.各组大鼠血清AST含量比较；B.各组大鼠血清ALT含量比较；C.各组大鼠血清TC含量比较；D.各组大鼠血清TG含量比较；a与Control组比较，P＜0.05；b与Model组比较，P＜0.05；c与ASI-L组比较，P＜0.05；d与ASI-H+Vector组比较，P＜0.05。
2.3 大鼠血清氧化应激及炎症因子水平变化
相较于Control组，Model组大鼠血清中MDA、IL-6和TNF-α水平明显增加，SOD、CAT活性明显下降（P＜0.05）；相较于Model组，随着ASI剂量的增大，ASI-L组、ASI-H组大鼠血清中MDA、IL-6和TNF-α水平显著降低，SOD、CAT活性显著升高（P＜0.05）；相较于ASI-H+Vector组，ASI-H+OV-miR-29b-3p组大鼠血清中MDA、IL-6和TNF-α水平明显增加，SOD、CAT活性明显下降（P＜0.05），见图3。
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图3 各组大鼠血清氧化应激及炎性因子水平比较（n=12）
Figure3.Comparison of serum levels of oxidative stress and inflammatory factors in different groups of rats (n=12)
注：A.各组大鼠血清IL-6和TNF-α水平比较；B.各组大鼠血清SOD、CAT活性比较；C.各组大鼠血清MDA含量比较；a与Control组比较，P ＜0.05；b与Model组比较，P＜0.05；c与ASI-L组比较，P＜0.05；d与ASI-H+Vector组比较，P＜0.05。
2.4 大鼠肝组织病理变化
Control组肝细胞分布均匀，胞质染色均匀，未见脂肪变性和脂肪空泡。Model组视野下可见常规病理脂肪空泡，肝脂肪变性较严重，炎症细胞浸润增多。随着ASI剂量的增加，ASI-L、ASI-H组大鼠肝细胞内脂肪空泡数明显减少，肝脂肪变性程度及炎症细胞浸润程度减轻。ASI-H+OV-miR-29b-3p组相较于ASI-H+Vector组大鼠肝组织病理损伤更重，见图4。
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图4 各组大鼠肝组织HE染色（n=12）
Figure4.HE staining of liver tissue in different groups of rats (n=12)
注：标尺.50 μm；放大比例.×200。
2.5 大鼠肝组织中miR-29b-3p和FoxO3 mRNA表达水平
相较于Control组，Model组大鼠肝组织中miR-29b-3p表达升高，FoxO3 mRNA降低（P＜ 0.05），miR-29b-3p与FoxO3具有负相关性（r= -0.751，P＜0.05）；相较于Model组，随着ASI剂量的增加，ASI-L组、ASI-H组大鼠肝组织中miR-29b-3p表达水平逐渐降低，FoxO3 mRNA表达水平逐渐升高（P＜0.05）；相较于ASI-H+Vector组，ASI-H+OV-miR-29b-3p组miR-29b-3p表达水平显著升高，FoxO3 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05），见图5。
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图5 各组大鼠肝组织中miR-29b-3p和FoxO3 mRNA表达水平比较（n=6）
Figure5.Comparison of mRNA expression levels of miR-29b-3p and FoxO3 in liver tissues of rats in different groups (n=6)
注：a与Control组比较，P＜0.05；b与Model组比较，P＜0.05；c与ASI-L组比较，P＜0.05；d与ASI-H+Vector组比较，P＜0.05。
2.6 大鼠肝组织中FoxO3及凋亡相关蛋白表达变化
相较于Control组，Model组大鼠肝组织中FoxO3和Bcl-2蛋白表达水平均显著降低，Caspase 3蛋白表达量明显升高（P＜0.05）；相较于Model组，随着ASI剂量的增加，ASI-L组、ASI-H组大鼠肝组织中FoxO3和Bcl-2蛋白表达水平均显著升高，Caspase 3蛋白表达量明显降低（P＜0.05）；相较于ASI-H+Vector组，ASI-H+OV-miR-29b-3p组大鼠肝组织中FoxO3和Bcl-2蛋白表达水平明显降低、Caspase 3蛋白表达量明显升高（P＜0.05），见图6。
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图6 各组大鼠肝组织中FoxO3和凋亡蛋白表达水平及定量分析（n=6）
Figure6.Comparison of FoxO3 and apoptotic protein expression levels in liver tissues of rats in different groups (n=6)
注：a与Control组比较，P＜0.05；b与Model组比较，P＜0.05；c与ASI-L组比较，P＜0.05；d与ASI-H+Vector组比较，P＜0.05。
2.7 靶向关系验证
miR-29b-3p和FoxO3存在靶向结合位点。FoxO3-WT+OV-miR-29b-3p组细胞相对荧光素酶活性显著下降（P＜0.05），见图7和表1。
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图7 miR-29b-3p和FoxO3的互补位点
Figure7.Complementary sites of miR-29b-3p and FoxO3
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表格1 miR-29b-3p和FoxO3的靶向关系验证
Table1.Verification of the targeting relationship between miR-29b-3p and FoxO3
3 讨论
NAFLD是一种病理机制复杂的慢性疾病。研究表明，NAFLD 患者肝组织存在明显的炎症反应与氧化应激损伤，但其具体病理机制尚未完全阐明。在临床治疗中，该病多采用药物联合干预的方案，然而由于疗效欠佳且机体易产生耐药性，不仅造成了沉重的经济负担，还严重影响患者及其家庭的生活质量。因此，积极探寻经济安全、无副作用的药物，对患者个体及整个社会而言具有重要意义。ASI是一种来源于积雪草的化合物，具有抗肿瘤、调节机体能量代谢等广泛生理活性 [14-15]。Wei等[16]研究指出ASI可通过降低机体炎症和氧化应激反应缓解NAFLD进展，但目前关于ASI改善NAFLD的具体作用机制还不清楚。
肝脏中脂质积累引起的脂代谢紊乱是导致NAFLD的重要诱因。血清中AST、ALT是反映肝实质损害的重要指标。其中ALT最为敏感，报告指出即便肝细胞少量坏死，ALT的含量也会成倍增加[17]。TC、TG水平是临床上检测机体脂代谢异常的常用参考指标，其水平升高时可诱发心血管疾病[18]。本研究结果显示NAFLD大鼠肝脏质量和肝指数、血清中TC、TG、AST、ALT水平均显著提高，且肝组织病损程度严重，提示NAFLD建模成功。经ASI干预治疗后上述指标均有明显好转，表明ASI可调节脂代谢、改善肝脂肪变性和肝损伤。
既往研究表明ASI改善疾病的途径可通过调节多种信号轴，如ASI通过激活AMPK/Nrf2通路发挥对糖尿病心肌病心脏的保护作用[19]；ASI通过调节miR-635/HMGA1轴诱导内质网应激，发挥抗癌功效[20]。miRNAs在多种疾病中发挥重要作用，相关研究通过微阵列分析认为miRNAs可能参与NAFLD的发病机制，其中miR-29b-3p在NAFLD患者中异常高表达[7]。目前miR-29b-3p已被发现在调节脂代谢和肝纤维化方面发挥重要作用[10]。miR-29b-3p与多种核苷酸的3'-非翻译区结合负调节相关功能基因的表达，从而发挥生物学功能。本研究预测发现FoxO3与miR-29b-3p存在互补位点，且通过双荧光素酶报告基因实验进行了验证。FoxO3参与NAFLD发展中的脂质代谢、炎症反应和纤维化[21]，其含量提高可增强抗氧化酶活性，减轻NAFLD机体炎症和氧化应激损伤[22]。肝脏中脂质的积累会破坏氧化还原系统的平衡，导致氧化应激反应加剧、细胞凋亡[2]。目前已有研究表明miR-122-5p通过靶向FoxO3改善饮食诱导的NAFLD炎症和氧化应激损伤[23]。但关于miR-29b-3p靶向FoxO3在NAFLD中还未有研究，因此miR-29b-3p/FoxO3轴可能成为治疗NAFLD的关键通路。本研究结果显示NAFLD大鼠机体氧化应激和炎症反应加剧、肝组织FoxO3蛋白表达下调、miR-29b-3p水平及Caspase 3蛋白表达上调；而随着ASI治疗后，大鼠氧化应激和炎症反应减轻，肝组织miR-29b- 3p水平逐渐下降、FoxO3及Bcl 2蛋白表达量逐渐升高，提示ASI可下调miR-29b-3p的表达进而上调FoxO3 mRNA的表达，发挥抗氧化、抗炎、改善肝损伤的功效。本研究在高剂量ASI干预的同时尾静脉注射miR-29b-3p过表达质粒，结果显示由于miR-29b-3p的高表达，FoxO3 mRNA表达水平下调，ASI对NAFLD大鼠肝脏氧化应激、炎症反应及脂代谢的改善作用被逆转，进一步证明ASI对NAFLD肝保护的作用与miR-29b-3p/FoxO3轴有关。ASI已被广泛用于治疗多种疾病，如体外已用于人角膜上细胞的损伤修复治疗 [24]。奥贝胆酸等传统药物治疗NAFLD给患者带来瘙痒、加速肝功能衰竭等不良反应[25]，而目前ASI用于治疗NAFLD大鼠无不良反应，可能具有临床治疗前景。
综上，ASI可增强NAFLD大鼠抗氧化和抗炎能力、调节脂代谢、改善肝组织病损，其作用机制可能与miR-29b-3p/FoxO3轴有关。本研究仍存在不足之处：未明确ASI治疗NAFLD大鼠的最佳药物干预剂量，且关于ASI是通过直接或间接调节miR-29b-3p的表达也有待进一步研究。
伦理声明：本研究经武汉市第三医院实验动物伦理委员会审核批准（批号：武三医实伦SY2022-054）
作者贡献：实验操作：占婷、陈明涛、陈爱方、黄敏；数据采集：田霞；数据分析：韩峥、朱庆曦；实验设计及论文撰写：谭洁；论文指导：刘蒙
数据获取：本研究中使用和（或）分析的数据可联系通信作者获取
利益冲突声明：无
致谢：不适用
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