目的  探讨DNASE1L3在肾纤维化中的作用及机制研究。

方法  结扎小鼠单侧输尿管构建体内肾纤维化模型，采用RT-qPCR和WB检测肾脏中DNASE1L3的mRNA和蛋白表达水平；使用TGF-β诱导HK-2细胞构建体外纤维化模型，采用WB检测DNASE1L3的蛋白表达水平；使用GEO数据库联合GO富集和KEGG通路富集分析DNASE1L3可能相互作用的基因及功能；体外实验在HK-2细胞纤维化模型中采用瞬时转染敲低或过表达DNASE1L3进行肾纤维化的功能和机制研究。

结果  DNASE1L3基因在肾纤维化的体内外模型中均表达上调；体外细胞实验中敲低DNASE1L3促进细胞上皮间充质转化，过表达DNASE1L3可有效抑制上皮间充质转化；生信分析结果显示DNASE1L3 mRNA与多种免疫相关生物学过程和炎症信号通路相关；进一步机制研究发现DNASE1L3通过抑制PI3K-AKT通路相关信号分子的磷酸化来抑制肾纤维化的进展。

结论  DNASE1L3通过抑制PI3K-AKT信号通路抑制肾纤维化的进程，为肾纤维化的机制研究提供理论依据。

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）在全球的发病率为10%~14%，我国成年人群中有1/10罹患CKD，CKD已经成为危害人类健康的重大公共卫生问题[1-2]。CKD的临床特征主要表现为早期诊断率低、晚期不可逆性的肾功能下降[3]。在CKD疾病进展过程中，肾脏结构发生变化并由于纤维蛋白沉积等原因出现纤维化，最终进展为终末期肾脏病[4-5]。虽然近年来人们对肾纤维化的发病机制及治疗策略的研究取得了一些进展，但对其早期监控和有效治疗靶点的研究并未取得实质性的突破[6]。因此，探索肾纤维化潜在的发病机制，揭示肾纤维化的病理变化机制，寻找有效的治疗靶点刻不容缓。

脱氧核糖核酸酶1（deoxyribonuclease 1，DNase1）家族蛋白是一类具有脱氧核糖核酸内切酶活性的蛋白，该家族蛋白主要介导调控多种免疫相关疾病[7]。人体中存在4个DNase1家族基因，即DNASE1、DNASE1L1、DNASE1L2及DNASE1L3，其中DNASE1L3蛋白的编码基因位于3号染色体短臂。DNASE1L3能够在细胞外切割单链或双链DNA，以维持血浆DNA的稳态。而在细胞内，DNASE1L3可以由内质网易位至细胞核参与核小体DNA的片段化[8-9]。DNASE1L3作为一种重要的生物学分子，已被证明具有抗炎、抑制肿瘤、抗DNA自身免疫等广泛的生物学功能。例如，DNASE1L3可以水解中性粒细胞外陷阱或凋亡小体中的DNA来抑制过度炎症或抑制免疫系统过度激活[10-12]。大量证据表明过度炎症在肾纤维化的发生发展过程中起着核心作用[13]。然而，能否通过DNASE1L3来调控肾纤维化的进展，亟需进一步研究。

本研究通过构建单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）诱导的小鼠肾纤维化模型和转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）诱导的人肾近曲小管上皮细胞株（human kidney-2，HK-2）细胞纤维化模型，对DNASE1L3在肾纤维化中发挥的作用及其具体作用机制进行了探索，以期为肾纤维化的机制研究和靶向治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和饲养

从三峡大学购入8周龄的野生型C57BL/6J雄性小鼠，体重20~24 g。小鼠生活在无特定病原体的标准环境中，温度22~24 ℃，湿度40%~70%，12 h光暗循环，正常进食。本研究已通过武汉市第三医院动物伦理委员会审批（批号：武三医实伦SY2024-012）。

1.1.2 细胞

HK-2购自中国科学院细胞库（No. SCSP-511，上海），使用前对支原体和衣原体进行了检测，结果呈阴性。

1.1.3 主要试剂

E-cadherin（E-ca）（#GB11868）一抗购自赛维尔生物科技有限公司，α-SMA（#14395-1-AP）、DNASE1L3（#67041-1-Ig）、β-actin（#66009-1- Ig）、p-AKT（#28731-1-AP）及AKT（#10176-2-AP）一抗购自三鹰生物技术有限公司，纤连蛋白（FN）（#AB2413）一抗购自英国Abcam公司，p-PI3K（#AF3241）、PI3K（#AF6241）一抗购自Affinity公司，山羊抗兔IgG（#GB25303）、山羊抗鼠IgG（#GB25301）购自赛维尔生物科技有限公司，DMEM/F12（#G4612）培养基购自赛维尔生物科技有限公司，TGF-β（#100-21）购自美国PeproTech公司，LipofectamineTM 2000转染试剂（#11668019）购自Invitrogen公司，PI3K抑制剂LY294002（#L9908）购自Merck公司，siRNA及过表达质粒由通用生物公司设计并提供。

1.2 方法

1.2.1 小鼠UUO模型的构建

使用小鼠UUO模型模拟梗阻性肾纤维化的过程。雄性8周龄的C57BL/6J小鼠，体重20~24 g，适应性饲养一周后，将野生型小鼠随机分为假手术（Sham）组和UUO组，所有小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，UUO组小鼠剖腹后经腹部右侧切口用5-0丝线在肾盂下0.5~1 cm处双重打结结扎右侧输尿管，假手术组进行右侧输尿管暴露后缝合，不进行损伤性操作。在手术后7 d，使用过量CO₂法处死小鼠（每组8只），取小鼠肾脏和血清储存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 细胞培养、模型构建和细胞转染

HK-2细胞在5% CO₂、恒温37 ℃环境中培养，完全培养基成分为DMEM/F12培养基混合10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。细胞富集至培养瓶底80%~90%后，使用PBS清洗2次后胰酶消化分装传代继续培养。

为模拟肾纤维化的体外模型，使用TGF-β诱导HK-2细胞进行造模。6孔板中的细胞用单纯DMEM/F12培养基饥饿孵育过夜后，用不同浓度的TGF-β（0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL及20  ng/ mL）处理，继续在完全培养基中培养24 h，然后收集细胞提取RNA或蛋白进一步分析。

将1×10⁶个细胞均匀接种至6孔板进行质粒或siRNA转染。6孔板中细胞富集至30%~50%后，利用LipofectamineTM 2000与siRNA或质粒进行转染4~6 h。细胞转染后换液，在完全培养基中继续培育48~96 h后提取蛋白，通过Western blot（WB）评估细胞转染效率。

1.2.3 生物信息学分析

本研究中临床样本肾脏DNASE1L3蛋白表达水平从人类蛋白图谱（The Human Protein Atlas，HPA，https://www.proteinatlas.org）数据库提取。

本研究中公共数据库数据来源于GEO DateSets数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。R 4.4.1软件用于数据分析及可视化，dplyr包用于数据清洗及预处理，limma包用于差异基因及相关性分析，Pearson分析用于DNASE1L3相关基因分析（r ＞0.5，P＜0.05），clusterProfiler包用于GO及KEGG通路富集分析，ggplot2包用于对富集分析结果进行可视化。

1.2.4 WB实验

提取细胞或组织总蛋白后，所有蛋白样本通过BCA试剂盒（赛维尔生物科技有限公司）检测蛋白浓度并进行归一化处理，蛋白样品在6%~12% SDS-PAGE凝胶中分离，随后转移至PVDF膜。5%牛血清白蛋白（BSA）封闭。用不同一抗在4 ℃孵育12 h后1×TBST洗涤3次，用二抗孵育1 h，在1×TBST洗膜后，使用Bio- Rad双色红外激光成像系统对PVDF膜显影。Image Lab和ImageJ 1.53k软件用于对采集的图像进行后续分析。

1.2.5 qPCR实验

使用EastepTM Super总RNA提取试剂盒（Promega公司）从小鼠肾组织或细胞中提取总RNA，并用逆转录反应试剂盒（TOYOBO）进行逆转录。使用SYBR Green qPCR master mix在95  ℃环境进行15 min的初始变性，然后在94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s和72  ℃ 1 min的程序中循环35个周期。以GAPDH为对照，采用2^-△△CT法测定mRNA水平的相对变化。引物序列如下：鼠源DNASE1L3上游引物序列为5'-CGGACCCCAAGTTTGTTTGG-3'，下游引物序列为5'-GTCCACAAAGCACAATCCTGT-3'；人源FN上游引物序列为5'-TCAGCTTCCTGGC ACTTCTG-3'，下游引物序列为5'-TCTTGTCCT ACATTCGGCGG-3'；人源COL^-1上游引物序列为5'-AGTGGTTTGGATGGTGCCAA-3'，下游引物序列为5'-GCACCATCATTTCCACGAGC-3'。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0.2分析实验数据，并以均数和标准差（）表示。两组间数据比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析或双因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意 义。

2 结果

2.1 UUO小鼠模型肾脏组织中DNASE1L3的表达上调

为研究肾纤维化进程中DNASE1L3表达水平的变化，本研究通过结扎小鼠单侧输尿管构建了小鼠UUO肾纤维化模型。WB结果显示，与假手术（Sham）组相比，UUO组小鼠模型肾脏中的纤维化标志物α-SMA、FN的蛋白表达显著上调，E-ca的蛋白表达显著下调（图1-A至图1-D）。DNASE1L3蛋白表达水平的检测结果显示，较Sham组，UUO组小鼠肾脏中DNASE1L3的蛋白和mRNA水平均明显上调（图1-E至图1-G）。以上结果表明，DNASE1L3可能参与肾纤维化的进程。

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  图1 UUO小鼠模型肾脏中DNASE1L3的表达情况

  Figure1.DNASE1L3 expression in kidney of UUO model

  注：A-D. Sham组和UUO组小鼠肾脏组织中E-ca、α-SMA和FN蛋白的表达情况和蛋白印迹定量分析（n=3）；E-F. Sham组和UUO组小鼠肾脏组织中DNASE1L3蛋白的表达情况和蛋白印迹定量分析（n=3）；G. Sham组和UUO组小鼠肾脏组织中DNASE1L3 mRNA的表达情况（n=6）；*P ＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

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2.2 DNASE1L3在肾小管上皮细胞中丰富表达

为了进一步明确DNASE1L3在肾脏中发挥作用的细胞类型，本研究从HPA数据库提取出DNASE1L3在临床样本中的蛋白表达水平进行分析，相较于其他细胞类型，DNASE1L3在肾小管上皮细胞中的表达丰度明显更高（图2）。以上结果表明DNASE1L3可能在肾小管上皮细胞中，而非其他类型细胞中发挥主要作用。

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  图2 DNASE1L3在肾脏细胞中的表达丰度

  Figure2.Expression abundance of DNASE1L3 in renal cells

  注：临床样本中DNASE1L3的蛋白表达水平从HPA数据库中提取；左图标尺. 200 μm；右图标尺. 50 μm。

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2.3 TGF-β诱导的HK-2细胞纤维化模型中DNASE1L3的表达上调

为了进一步研究体外模型中DNASE1L3的表达水平，本研究以不同浓度的TGF-β（0 ng/ mL、5 ng/mL、10 ng/mL及20 ng/mL）诱导HK-2细胞构建体外纤维化模型。WB和qPCR的结果显示，10 ng/mL的TGF-β诱导24 h时，细胞模型构建较为稳定（图3-A至图3-F）。随后WB结果提示，DNASE1L3在TGF-β诱导的HK-2细胞模型中的蛋白表达上调（图3-G、图3-H），与体内实验结果一致。上述所有结果表明DNASE1L3可能参与肾纤维化的发生发展。

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  图3 HK-2细胞纤维化模型中DNASE1L3的表达情况

  Figure3.Expression of DNASE1L3 in HK-2 cell fibrosis model

  注：A-D. 不同浓度TGF-β（0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL及20 ng/mL）诱导下HK-2细胞中E-ca、α-SMA和FN蛋白的表达情况和蛋白印迹定量分析（n=3）；E-F. 不同浓度TGF-β诱导下HK-2细胞中FN和CoL-1 mRNA的表达情况（n=3）；G-H. 不同浓度TGF-β诱导下HK-2细胞中DNASE1L3蛋白的表达情况和蛋白印迹定量分析（n=3）；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

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2.4 敲低DNASE1L3促进肾小管细胞的上皮间充质转化

为探索DNASE1L3在肾纤维化中扮演的角色，本研究在体外模型中构建了瞬时转染敲低DNASE1L3的HK-2细胞系，敲低效率通过WB实验得到验证（图4-A、图4-B）。进一步的WB结果显示，在TGF-β诱导的细胞模型组中，敲低DNASE1L3促进了促上皮-间充质转化（EMT）相关基因（FN、α-SMA）的蛋白表达，而抗EMT相关基因（E- ca）的表达则明显降低，上述结果证实了体外敲低DNASE1L3可以加重HK-2细胞的EMT（图 4-C至图4- F）。

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  图4 体外敲低DNASE1L3对HK-2细胞EMT相关蛋白的影响

  Figure4.Effects of DNASE1L3 knockdown on EMT-related proteins in HK-2 cell in vitro

  注：A-B. HK-2细胞中DNASE1L3敲低效率的蛋白鉴定结果及蛋白印迹定量分析（n=3）；C-F. 敲低DNASE1L3后HK-2细胞中E-ca、α-SMA和FN蛋白的表达情况和蛋白印迹定量分析（n=3）；*P ＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

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2.5 过表达DNASE1L3抑制肾小管细胞的EMT

为双重验证DNASE1L3在肾纤维化中的生物学功能，本研究成功构建了瞬时转染过表达DNASE1L3的HK-2细胞系，并通过WB得到验证（图5-A、图5-B）。随后，检测了细胞中E-ca、α-SMA和FN的蛋白表达水平，结果显示，在TGF-β诱导的细胞模型组中，OE-DNASE1L3组较Vector组促EMT相关基因（FN、α-SMA）的表达水平显著下调，而抗EMT相关基因（E-ca）的表达则显著上调（图 5-C至图5-F）。以上结果提示过表达DNASE1L3在肾纤维化体外模型发挥重要保护作用。

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  图5 体外过表达DNASE1L3对HK-2细胞EMT相关蛋白的影响

  Figure5.Effect of DNASE1L3 overexpression on EMT-related proteins in HK-2 cell in vitro

  注：A-B. HK-2细胞中DNASE1L3过表达效率的蛋白鉴定结果及蛋白印迹定量分析（n=3）；C-F. 过表达DNASE1L3后HK-2细胞中E-ca、α-SMA和FN蛋白的表达情况和蛋白印迹定量分析（n=3）；*P ＜0.05，**P＜0.01。

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2.6 DNASE1L3相关基因的GO和KEGG分 析

为深入探究DNASE1L3调控肾纤维化的具体机制，本研究在GEO公共数据库下载了数据集GSE217650进行生物信息学分析。首先清除低表达量数据，以R＞0.6、P＜0.05为标准筛选出与DNASE1L3基因表达变化相关的基因，随后对该基因集进行GO功能富集和KEGG通路富集分析（图 6-A、图6-B）。GO功能富集结果显示，这些基因主要参与细胞间黏附的调节（GO：0022407，regulation of cell-cell adhesion）、细胞前缘（GO：0031252，cell leading edge）、转录共调节因子活性（GO：0003712，transcription coregulator activity）等生物学过程。KEGG通路富集分析结果表明，上述基因主要富集在PI3K-AKT通路（mmu04151，PI3K-Akt signaling pathway）、MAPK通路（mmu04010，MAPK signaling pathway）、细胞因子-细胞因子受体相互作用（mmu04060，Cytokine-cytokine receptor interaction）。

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  图6 DNASE1L3 mRNA表达相关基因的GO分析和KEGG通路富集分析

  Figure6.GO analysis and KEGG pathway analysis of related genes of DNASE1L3 mRNA expression

  注：A. GO富集分析；B. KEGG通路富集分析。

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2.7 DNASE1L3靶向PI3K-AKT信号通路

结合生物信息学分析，为验证DNASE1L3是否通过PI3K-AKT信号通路调控肾纤维化的进程，本研究在体外纤维化模型中检测了DNASE1L3对PI3K-AKT通路相关信号分子p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达水平的影响。实验结果发现，在TGF-β诱导的体外细胞模型组中，与对照组对比，敲低DNASE1L3后，p-PI3K和p-AKT的表达均显著升高（图7-A至图7-C）；而过表达DNASE1L3后，p-PI3K和p-AKT的表达明显降低（图7-D至图7-F）。上述实验结果初步验证了DNASE1L3通过影响PI3K-AKT信号通路的激活进而影响肾纤维化的进程。

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  图7 体外调控DNASE1L3对PI3K-AKT信号通路相关蛋白的影响

  Figure7.Effect of regulating DNASE1L3 on PI3K-AKT signaling pathway-related proteins in vitro

  注：A-C. 敲低DNASE1L3后HK-2细胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT蛋白的表达情况和蛋白印迹定量分析（n=3）；D-F. 过表达DNASE1L3后HK-2细胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT蛋白的表达情况和蛋白印迹定量分析（n=3）；*P ＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

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2.8 DNASE1L3依赖PI3K-AKT信号通路调控肾纤维化

为了进一步阐明DNASE1L3在调节肾纤维化过程中是否依赖于PI3K/AKT信号通路来发挥作用，使用PI3K特异性抑制剂LY294002进行体外回复实验。WB结果显示在TGF-β诱导的HK-2细胞纤维化模型中，敲低DNASE1L3后EMT相关基因FN和α-SMA的表达显著升高，E-ca的表达显著下降；随后，在敲低DNASE1L3的同时加入LY294002后EMT表型回复（图 8-A至图 8- C）。以上结果证明，DNASE1L3依赖PI3K/AKT信号通路来调节肾纤维化。

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  图8 体外敲低DNASE1L3且抑制PI3K对HK-2细胞EMT相关蛋白的影响

  Figure8.Effects of knocking down DNASE1L3 and inhibiting PI3K on EMT-related proteins in HK-2 cell in vitro

  注：A-D. 敲低DNASE1L3并抑制PI3K-AKT信号通路后HK-2细胞中E-ca、α-SMA和FN蛋白的表达情况和蛋白印迹定量分析（n=3）；*P ＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

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3 讨论

肾纤维化是梗阻性肾病、狼疮性肾病等多种慢性肾脏疾病发展为终末期肾脏病过程中不可避免的病理改变[4, 13-14]。肾纤维化的动态进展过程中促纤维化微环境形成、炎症过度激活、肾小管上皮细胞损伤、肌成纤维细胞激活、细胞外基质沉积，最终致使肾脏结构和功能发生不可逆性损害[15-16]。虽然目前针对肾纤维化患者已有一些药物可以起到部分疗效，但患者肾功能进行性下降和晚期生活质量堪忧等问题仍然严峻[2, 17]。因此，揭示肾纤维化的发病机制、寻找新的靶向治疗策略迫在眉睫。

本研究从动物和细胞层面揭示了DNASE1L3在肾纤维化进展过程中的重要作用以及机制。主要结果总结如下：①DNASE1L3在UUO诱导的肾纤维化模型及TGF-β诱导的HK-2细胞纤维化模型中的表达水平显著升高；②在体外TGF-β诱导的HK-2细胞纤维化模型中，与对照组相比，敲低DNASE1L3后促进EMT，而过表达DNASE1L3可抑制EMT；③DNASE1L3通过PI3K-AKT信号通路调控肾纤维化的进展。

DNASE1L3是脱氧核糖核酸酶1家族的成员之一，主要通过巨噬细胞、树突状细胞分泌，是一种免疫相关蛋白。既往研究表明，DNASE1L3在清除游离DNA片段、抑制肿瘤增殖转移等生物功能中发挥重要作用[18-19]。但是，DNASE1L3在肾间质纤维化中的作用暂未见报道，有待进一步研究。本研究结果显示在体内外纤维化模型中，DNASE1L3表达水平明显上调，这表明在纤维化过程中DNASE1L3被诱导表达，DNASE1L3可能参与了肾纤维化的发生发展过 程。

DNASE1L3在抑制机体自身过度免疫和抗炎方面起着至关重要的作用，在细胞外，DNASE1L3可以通过降解凋亡微粒发挥作用，而内源性的DNASE1L3则可以易位至细胞核并片段化核小体[20]。近年来，DNASE1L3在肿瘤方面的作用也引起广泛关注，在肝细胞癌和肺腺癌等多种肿瘤中，DNASE1L3通过抑制细胞增殖、迁移、侵袭和血管形成等生物学过程来抑制肿瘤的进展 [19, 22]。但是在肾纤维化中，DNASE1L3扮演的角色尚不清楚。本研究发现DNASE1L3可抑制肾小管上皮细胞的间质转化过程，这说明DNASE1L3在肾纤维化过程中可能起着重要调节作用。

PI3K-AKT通路是生物过程中一个至关重要的信号传导路径，在多种疾病，尤其是纤维化疾病中扮演着关键角色[22]。在细胞质中，PI3K首先被酪氨酸激酶激活，将PIP2磷酸化为PIP3，进而促进AKT的募集，AKT的活化进一步促进各种生物学功能的进行[22]。本团队既往研究发现在肾纤维化过程中，STAP2可以靶向HSP27的磷酸化，进而激活PI3K-AKT信号通路来促进肾纤维化的进展[23]。本研究通过生物信息学分析初步发现PI3K-AKT通路为DNASE1L3的效应通路之一并进行回复验证，证实DNASE1L3依赖PI3K- AKT通路调控肾纤维化这一病理过程。

由于肾纤维化的不可逆性，临床实践更倾向于早期筛查和诊断肾损伤人群并实施针对性的干预措施[13]。本研究发现，DNASE1L3在肾纤维化的体内外模型中均出现显著上调，这为肾纤维化的早期诊断提供了一个潜在的靶点。此外，在细胞中过表达DNASE1L3能够抑制细胞EMT，同时也能抑制PI3K-AKT信号通路的激活。过表达DNASE1L3在抑制细胞EMT进展中所起的作用与PI3K特异性抑制剂LY294002相似，这为临床治疗提供了延缓肾纤维化进展的潜在治疗靶点。

本研究也存在一些局限性，例如，对于DNASE1L3的机制研究仅局限于HK-2细胞，而未进行体内实验。此外，DNASE1L3通过PI3K-AKT通路调控肾纤维化的机制仅进行了初步研究，DNASE1L3调控PI3K-AKT通路的具体方式以及该蛋白发挥作用的具体结构域有待进一步研 究。

总之，本研究证实DNASE1L3通过靶向PI3K-AKT通路抑制肾纤维化的进展。DNASE1L3有望成为肾纤维化的诊断和治疗的新靶点，为后续肾纤维化机制的研究以及靶向治疗纤维化提供新的思路和策略。

伦理声明：本研究已获得武汉市第三医院动物伦理委员会审批（批号：武三医实伦SY2024-012）

作者贡献：研究设计：罗鹏程、杨军；实验操作：魏晓、于鸿；数据采集：魏晓、袁远；数据分析：魏晓、匡崎辉；论文撰写：魏晓；论文审定：罗鹏程、杨军和王雄

数据获取：本研究中使用和（或）分析的数据可联系通信作者获取

利益冲突声明：无

致谢：不适用

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