目的  分析尿液髓系生态型病毒插入位点1（myeloid ecotropic viral integration site 1，MEIS1）基因甲基化在膀胱癌早期诊断中的应用价值。

方法  选取2023年8月至2024年5月哈尔滨医科大学附属肿瘤医院膀胱癌患者及非肿瘤患者作为建模队列，使用尿液及组织样本，联合癌症基因组图谱（TCGA）、基因表达综合数据库（GEO）中数据进行基因甲基化差异性分析，确定膀胱癌特异性甲基化标志物。选取2024年6月至2024年10月的膀胱癌患者及非肿瘤患者作为验证队列，通过与术后病理结果比较分析MEIS1的诊断价值。

结果  共纳入297例研究对象，其中建模队列中膀胱癌患者94例、非肿瘤患者83例，验证队列中膀胱癌患者90例、非肿瘤患者30例。建模队列、TCGA和GEO数据分析筛选出HOXA9、CRTR、TWIST1、MEIS1、IFR8 5个基因，以甲基化背景低且癌旁、癌组织甲基化差异程度高为标准进一步筛选（AUC≥0.9），确定MEIS1基因作为验证位点。验证队列中，MEIS1基因甲基化区分膀胱癌和正常患者的准确性、敏感度、特异度分别为89.2%、91.1%、83.3%，与金标准的阳性检出率差异无统计学意义（P ＞0.05）。

结论  尿液MEIS1基因甲基化检测在膀胱癌的无创尿液诊断领域具有重要的临床价值。

膀胱癌（bladder cancer，BCa）作为全球第二大最常见的泌尿系统恶性肿瘤[1]，每年约有55万例新发病例[2]，同时也是导致男性癌症死亡的主要原因之一。BCa的高复发性同样受到广泛关注，数据表明BCa术后五年复发率为50%~70%[3]，且尿路上皮癌早期症状相对不明显，许多患者就诊时多已浸润肌层，预后相对较差[4]，这对患者的日常生活质量及整个医疗体系构成了沉重负担。传统的BCa诊断手段包括膀胱镜检查、肿瘤标志物及尿液细胞学检查，但这些检查不可避免地存在操作侵入性强、易引发患者不适及阴性结果无法排除诊断等问题[5-6]。有文献表明，BCa被认为是治疗成本最高的恶性肿瘤[7]。

近年来，液体活检作为一种新兴的非侵入性检测技术，逐渐崭露头角并受到了广泛关注 [8]。该技术通过对血液或尿液中的循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）及外泌体等生物标志物进行深入分析以期达到肿瘤的早诊早筛。尿液富含肿瘤相关蛋白质、DNA和RNA[9]，可以提供BCa中发现的多种分子物质，能够揭示肿瘤的分子特征及其动态变化信息，在肿瘤的早期筛查、诊断、疗效监测及预后评估等多个方面展现出巨大潜力。

DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，逐渐显露出其在癌症诊断中的潜力。这种修饰不仅影响基因的表达，还与肿瘤的发展密切相关。研究表明特定基因的甲基化状态在BCa患者的尿液样本中具有显著变化，通过分析这些变化能够识别潜在的生物标志物，从而为早期诊断提供新的思路 [10]。因此，本研究通过对哈尔滨医科大学附属肿瘤医院BCa和泌尿系统良性疾病患者组织和尿液进行甲基化差异表达分析，同时结合数据库筛选BCa特异性甲基化标志物，确定髓系生态型病毒插入位点1（myeloid ecotropic viral integration site 1，MEIS1）基因作为关键基因，并在前瞻性队列中进一步验证，旨在探讨MEIS1作为BCa早期无创检查标志物的价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2023年8月至2024年10月就诊于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院的BCa患者作为肿瘤组，同期非癌症患者为对照组，包括泌尿系结石、泌尿道感染、前列腺增生和其他泌尿系统良性疾病。其中，2023年8月至2024年5月的两组患者作为建模队列，2024年6月至2024年10月的两组患者作为验证队列。纳入标准：①年龄≥18岁，性别不限；② 同意参加本研究并自愿签署知情同意书；③ 经病理确诊为BCa且为初次诊断（肿瘤组）；临床确诊为泌尿系结石、前列腺增生、泌尿道感染等非肿瘤良性疾病（对照组）；④ 取样前1个月内未接受过任何治疗，即未接受过任何针对本次确诊疾病的治疗。排除标准：① 当前或先前有其他恶性肿瘤史；②合并其他严重肝肾功能损害、糖尿病、严重感染以及心功能不全；③ 妊娠妇女。本研究已获得哈尔滨医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审批（批号：KY2023-63）。

1.2 样本收集

尿液样本的收集采用无菌尿液收集杯，要求参与者在早晨空腹状态下自取尿液。受检者签署知情同意书后如实填写样本信息登记表（是否空腹、晨尿等），然后自行采集尿液样本，收集后放至4 ℃冰箱；4 h内进行离心。离心前先预冷离心机，待离心机温度降到4 ℃后方可使用；先将尿液从尿杯移入15 mL离心管中，在4 ℃条件下将样本以3 000 rpm离心10 min。将离心后的上清倒入新的15 mL离心管中，每管不超过8  mL，管上贴好条码；沉渣保留在原管中。将分离得到的上清和沉渣放置于-80 ℃冰箱保存。

组织样本为接受根治膀胱全切术并经过病理证实的BCa组织及其配对的癌旁组织，癌旁组织的选择标准为距癌灶边缘5 cm以上。

1.3 表达数据下载和处理

基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库的450 K数据进行差异化甲基化位点的筛选，同时使用高通量DNA亚硫酸氢盐靶向测序技术对BCa和正常癌旁组织进行DNA甲基化分析。为了减少该分析中的统计偏差，排除性别、年龄、病理分级等临床信息缺失的BCa患者。

1.4 标志物筛选及验证

使用DSS包进行差异甲基化分析，根据严格的筛选标准（AUC≥0.9，甲基化率差异＞0.3）对上述数据进行筛选，随后采用Lasso回归对筛选后的高差异甲基化位点进行特征选择。使用Primer Premier 5.0设计甲基化特异性PCR（MSP）引物。采用荧光定量PCR测定样本的甲基化率，以基因（CT值）和内参基因（CT值）计算得到△CT值判定阳性或阴性结果，以膀胱镜或手术后病理活检为金标准，分析基因在尿上清cfDNA及尿沉渣gDNA中的阳性率，对选择出的位点进一步扩大样本量进行验证。

1.5 统计学分析

通过R 3.1.4软件进行统计学分析，使用DSS包进行差异基因分析，使用Lasso回归对筛选后的差异甲基化位点进行特征选择。符合正态分布的计量资料以均数和标准差（）表示；计数资料采用频数及百分比（n，%）描述。临床特征的组间差异比较采用χ²检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

在建模队列中，肿瘤患者94例，其中男性64例，女性30例，年龄33~88岁，平均年龄（64.98±10.63）岁。同期非癌症对照组患者83例，其中男性55例，女性28例，年龄30~85岁，平均年龄（60.19±8.86）岁。在验证队列中，肿瘤患者90例，非癌症患者30例，肿瘤与非癌症患者的年龄、性别、学历、婚姻状况及是否吸烟等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），流程见图1。

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  图1 研究工作流程

  Figure1.Workflow of the study

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2.2 PCa与正常组织DNA甲基化标志物差异分析

收集来自公开数据库（TCGA和GEO）的450K数据进行差异化甲基位点的筛选，下载了15例BCa患者组织和8例正常膀胱组织DNA甲基化数据。随后通过高通量 DNA 亚硫酸氢盐靶向测序对本研究队列的20对BCa和正常癌旁组织进行DNA甲基化分析。通过差异甲基化分析，队列中的1 200个标志物和TCGA和GEO联合队列中的2 032个标志物在BCa和正常组织之间发生显著变化。根据筛选标准，最终鉴定出5个标志物（HOXA9、CRTR、TWIST1、MEIS1、IFR8），这些标志物在肿瘤中显示出高且稳定的甲基化水平。

2.3 构建并寻找最佳标志物

为了找寻最佳标志物，本研究使用建模队列中的94例肿瘤患者和83例对照组患者的尿液，用荧光定量 PCR得到△CT值判定结果，并与病理情况进行比对，发现MEIS1等基因在尿上清cfDNA和尿沉渣gDNA中表现出较好的诊断性能，见表 1及表2，选取MEIS1基因继续扩大样本量进行验 证。

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  表格1 基于尿液cfDNA的膀胱癌甲基化标志物筛选

  Table1.Screening of bladder cancer methylation markers based on urinary cfDNA

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  表格2 基于尿沉渣gDNA的膀胱癌甲基化标志物筛选

  Table2.Screening of bladder cancer methylation markers based on urinary sediment gDNA

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2.4 MEIS1和病理结果的一致性分析

使用验证队列中的90例肿瘤患者和30例非肿瘤患者，以膀胱镜及术后病理结果为金标准，测得MEIS1基因甲基化灵敏度91.1%、特异度83.3%、阳性预测值 94.2%、阴性预测值75.8%。MEIS1基因甲基化阳性率与性别、年龄、吸烟史、是否出现血尿无关（P＞0.05），与TNM分期、组织学分级有关（P＜0.001），见表3。采用配对χ²检验分析MEIS1与病理金标准对BCa的阳性检出率差异没有统计学意义（P＞0.05），见表4。

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  表格3 临床病理特征与MEIS1甲基化的关系（n，%）

  Table3.Relationship between clinicopathologic features and MEIS1 methylation (n, %)

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  表格4 MEIS1甲基化和病理结果的一致性分析（n，%）

  Table4.Concordance analysis of MEIS1 methylation and pathological findings (n, %)

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3 讨论

本研究探索了DNA甲基化作为BCa尿液无创检测手段的潜力，并揭示了MEIS1与BCa发病之间的紧密联系。这一发现不仅为BCa的早期诊断开辟了新的生物标志物途径，同时也为临床实践带来了新的启示。

既往已有研究应用mRNA[11]、微管相关蛋白 [12]、拷贝数变异[13]、突变[14]等相关分析预测BCa的发生[15]。传统的BCa诊断方法，诸如膀胱镜检查，尽管诊断准确性高，但其侵入性操作往往给患者带来不适与痛苦，同时患者需要花费大量的治疗费用来应对BCa的诊断、复发和治疗，这导致BCa被认为是治疗成本最高的恶性肿瘤[16]。除此之外还有尿脱落细胞学检查和荧光原位杂交[17-18]等检查方法，但都有其局限性。尿液作为非侵入性样本来源，在癌症检测领域的应用价值日益凸显。本研究表明，通过检测尿液中DNA的甲基化状态，能够实现对BCa的无创筛查，这一方法不仅显著提升了患者的接受度，为大规模的人群筛查提供了现实可行的途径，还为后续进一步监测BCa复发相关研究提供了科学依据。

MEIS1作为三重氨基酸环延伸家族的成员，在细胞发育与增殖的过程中起着重要作用[19]。已有研究证实，MEIS1在白血病中发挥着癌基因的功能，驱动疾病的进展，包括促进白血病的发生、白血病细胞的归巢，以及增强细胞间的相互作用和迁移能力[20]。然而在其他类型的癌症中，MEIS1则作为肿瘤抑制因子发挥作用。有研究表明MEIS1在前列腺癌中展现出显著的肿瘤抑制作用，该研究发现MEIS1的表达水平在从良性上皮细胞向原发性肿瘤乃至转移组织的演变过程中逐渐下降，这种表达的降低与促瘤基因c-MYC和CD142的表达上调密切相关[21]。值得注意的是，MEIS1的基因表达与细胞周期蛋白A和D1的表达水平呈现出了明显的负相关关系，而与细胞促凋亡因子呈正相关，这表明MEIS1可能通过诱导细胞凋亡来发挥其肿瘤抑制作用[22]。此外，MEIS1还能诱导细胞周期阻滞于G1/S期，从而减弱高侵袭性肿瘤细胞的侵袭和迁移能力[23]。尽管MEIS1在多种癌症类型中的功能已经得到了一定程度的揭示，但关于其在BCa中的作用及其分子机制，目前仍缺乏详细的文献报道。因此，对于MEIS1在BCa中的功能进行深入的研究和阐述，将为该疾病的预防、诊断和治疗提供新的思路和策略。

本研究首先通过在医院、TCGA和GEO队列样本的联合分析中发现了BCa特异性甲基化标志物。然后，研究团队在94例肿瘤及83例良性疾病的队列中进一步筛选出诊断性能最佳的标志物，并在120个样本中对基于MEIS1甲基化诊断模型和病理结果进行了一致性分析，该甲基化位点灵敏度91.1%、特异度83.3%、阳性预测值 94.2%、阴性预测值75.8%，这充分展示了其在临床应用中的广阔前景。然而也必须认识到，当前研究的样本量相对有限，未来开展大规模前瞻性队列研究对于验证该标志物在BCa早期检测中的有效性至关重要。同时，甲基化的动态变化提供了一个全新的视角。随着BCa的发展，DNA甲基化模式可能会发生变化，这种变化不仅能够反映肿瘤的进展阶段，还可能在治疗监测中发挥重要作用[24]。因此，将甲基化分析与其他生物标志物（如拷贝数变异、mRNA等）相结合，进行多重检测，有望进一步提升诊断的准确性。

本研究仍存在一定的局限性。首先，甲基化检测的标准化流程尚未完全建立，实验方法的细微差异可能导致结果的可重复性受到影响。此外，职业暴露、吸烟、不同地理区域人群的甲基化特征可能存在差异[25-26]。因此，进一步开展多中心研究对于验证本研究的发现具有重要意义。随着DNA甲基化研究的深入和技术的不断进步，未来有望将这一方法广泛应用于临床实践，实现BCa的早期诊断、个体化治疗及预后评估目标，从而为BCa患者提供更加精准、有效的医疗服务。

伦理声明：本研究已获得哈尔滨医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审批（批号：KY2023-63）

作者贡献：研究设计：王子琦、佟智超、张振威；实验操作：张振威、胡胜；数据采集：张振威、王剑威、胡胜、李浩楠；数据分析：佟智超、张振威；论文撰写：张振威；论文审定：王子琦、佟智 超

数据获取：本研究中使用和（或）分析的数据可联系通信作者获取

利益冲突声明：无

致谢：不适用

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