膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）是一种泌尿系统常见的侵袭性恶性肿瘤，约占尿路恶性肿瘤的91.4%[1]，且预后差，复发率高，5年生存率低于15%[2-3]。目前的治疗方式，包括手术干预、化疗和免疫治疗，往往受到肿瘤复发和治疗耐药性等问题的限制导致预后较差。目前仍主要依赖膀胱镜和组织病理学检查进行诊断，无法为疾病快速进展的高风险患者提供及时干预，影响预后效果[4]。因此，迫切需要新的预后生物标志物和治疗靶点改善临床结果。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，在基因表达调控中起着关键作用。异常甲基化模式被发现与包括膀胱癌在内的多种癌症的发病密切相关，例如，肿瘤抑制基因的高甲基化可导致其沉默和随后的肿瘤发展，提示发挥基因表达调控重要作用的甲基化相关基因有望成为癌症诊断、预后和治疗反应的潜在生物标志物[5-6]。尽管DNA甲基化在癌症中的作用方面取得了进展，但现有的BLCA预后模型主要关注临床和病理特征，忽视了可提高预测准确性的分子特征，且结合临床数据的甲基化分子预测模型在常规临床实践中的应用仍然有限[7-8]。因此，本文将基因甲基化谱整合到模型中，旨在利用甲基化相关基因特征构建BLCA的预后模型，通过识别与疾病预后相关的特定甲基化模式，基于生物信息学方法验证甲基化标志物，以期为风险分层和治疗决策提供更精细的工具，完善临床BLCA患者个性化治疗计划，改善患者的预后，提高其生存率。
1 资料与方法
1.1 数据来源与处理
从TCGA数据库（https://portal.gdc.cancer.gov）下载BLCA患者临床数据。纳入标准：性别、年龄、BMI、病例分级、是否浸润等临床信息完整的患者数据。排除标准：无临床信息的患者数据及重复出现的相同患者数据。从GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）中搜索甲基化相关基因，筛选标准：①分类为蛋白质编码；②相关性得分大于5。
1.2 基因集富集分析
使用GSEA软件比较队列中高风险组和低风险组之间的表达谱差异，使用c2.cp.kegg.v7.0.symbols基因集来识别潜在的通路。应用GO和KEGG富集分析探讨预后基因的功能与参与通路。
1.3 免疫浸润分析
通过TIMER2.0数据库（http://timer.cistrome.org/）进行免疫浸润分析，探索甲基化相关基因与免疫细胞的免疫浸润丰度之间的相关性。
1.4 统计学分析
通过R 3.1.4软件进行统计学分析。单因素和多因素Cox回归分析筛选BLCA预后（生存/死亡）相关临床特征及甲基化相关基因。构建Lasso回归分析为基础的预后模型[9]，计算最佳风险临界值，并将患者分为高风险组和低风险组，绘制生存曲线并比较两组间的生存差异。采用受试者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线及曲线下面积（area under the curve，AUC）评估甲基化相关基因特征的预测性能。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况
共纳入411例BLCA患者，其中男性303例（73.72%），女性108例（26.28%）；T分期0期1例（0.24%），Ⅰ期4例（0.97%），Ⅱ期119例（28.95%），Ⅲ期195例（47.45%），Ⅳ期59例（14.36%），分期不明33例（8.03%）；N分期0期238例（57.91%），Ⅰ期46例（11.19%），Ⅱ期76例（18.49%），Ⅲ期8例（1.95%），分期不明43例（10.46%）；M分期0期199例（48.42%），Ⅰ期11例（2.67%），分期不明201例（48.91%）；病理分级低级别21例（5.11%），高级别387例（94.16%），分级不明确3例（0.73%）；肿瘤浸润152例（54.09%），无浸润129例（45.91%）。
2.2 甲基化相关基因的生物学功能分析
以“甲基化”作为检索词搜索GeneCards数据库并过滤筛选标准，获得了具有206个基因的甲基化基因集。将表达谱与生存信息相结合，并通过单因素Cox回归确定了24个（BDNF、CARM1、CAV1、COMT、CTNNB1、DLEC1、EGFR、FKBP5、H3C7、H4C14、ICMT、IGF2、MSH6、MYC、NR3C1、PCDH10、PRMT5、PRMT6、RARB、SETD7、SFRP1、SMYD2、THBS1、VHL）具有潜在预后价值的基因，甲基化水平如图1所示。
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图1 甲基化水平热力图
Figure1.Methylation level heat map
2.3 预后相关甲基化相关基因筛选
Lasso回归分析确定了11个回归系数为非零的基因（图2），包括CARM1、DLEC1、ICMT、IGF2、MYC、PRMT6、RARB、SMYD2、THBS1、VHL、EGFR。
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图2 Lasso回归
Figure2.Lasso regression
注：A为二项式偏差曲线；B为模型系数图；C为基因的Lasso系数图。
2.4 富集分析
KEGG富集分析的结果如图3所示。富集的KEGG途径和补体与凝血级联信号通路、神经活性配体-受体相互作用、酪氨酸代谢有关。
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图3 KEGG富集分析图
Figure3.KEGG enrichment analysis
GO富集分析的结果如图4所示。富集的GO途径与蛋白质甲基转移酶活性、S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶活性、组蛋白甲基转移酶活性、囊腔、血小板α颗粒管腔、血小板α颗粒、甲基化、大分子甲基化、蛋白质甲基化相关。
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图4 GO富集分析图
Figure4.GO enrichment analysis
2.5 甲基化基因的预后意义
单因素Cox回归分析结果显示，年龄、肿瘤浸润、T分期、N分期、M分期，以及CARM1、DLEC1、ICMT、IGF2、MYC、PRMT6、RARB、SMYD2、THBS1、VHL、EGFR 11个甲基化基因与患者预后显著相关。多因素Cox回归分析结果表明肿瘤浸润[HR=2.556，95%CI（1.190，5.491）]及IGF2高表达[HR=3.088，95%CI（1.348，7.075）]与BLCA预后不良相关，VHL高表达[HR=0.358，95%CI（0.151，0.845）]是BLCA预后的保护因素（表1）。
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表格1 单因素与多因素Cox回归分析结果
Table1.Results of univariate and multivariate Cox regression analysis
注：BMI.体重指数。
2.6 免疫浸润分析
通过TIMER2.0数据库的免疫浸润分析显示，包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、调节性T细胞和巨噬细胞在内的免疫细胞类型与鉴定的甲基化相关基因的表达显著相关（图5）。
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图5 免疫浸润图
Figure5.Immune infiltration
注：A为IGF2与巨噬细胞的免疫相关性；B为IGF2与调节性T细胞的免疫相关性；C为VHL与巨噬细胞的免疫相关性；D为VHL与调节性T细胞的免疫相关性；E为IGF2与CD8+ T细胞的免疫相关性；F为IGF2与CD4+ T细胞的免疫相关性；G为VHL与CD8+ T细胞细胞的免疫相关性；H为VHL与CD4+ T细胞细胞的免疫相关性。
2.7 预后模型的评估
通过R语言的survminer包计算回归模型的最佳风险临界值为1.448，将患者分为高风险组和低风险组。生存分析显示，在TCGA队列中，高危患者的总生存期显著低于低风险患者[HR=2.04，95%CI（1.50，2.76）]（图6-A）。1年、3年和5年总生存期的AUC值分别为0.773、0.719和0.725，表明Lasso模型具有良好的可预测性（图 6-B）。
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图6 KM曲线和ROC分析曲线
Figure6.KM curve and ROC analysis curve
注：A为高风险组和低风险组的生存曲线；B为预后相关风险模型的1、3、5年ROC分析曲线。
3 讨论
富集分析显示，甲基化相关基因和补体与凝血级联通路、神经活性配体-受体相互作用通路以及酪氨酸代谢通路显著相关。这些通路在肿瘤的发生、发展和预后中可能发挥重要作用。补体和凝血级联反应是免疫反应和止血的关键组成部分，在炎症和组织修复过程中发挥着关键作用[10]。这种途径的失调与包括BLCA在内的多种肿瘤进展和转移密切相关[11]。神经活性配体-受体相互作用途径涉及神经元与其他细胞类型之间通过神经递质及其受体进行交流，从而影响癌症细胞的增殖、迁移和侵袭[12]。这种途径的富集表明甲基化相关基因可能通过调节神经活性信号机制来影响膀胱癌的进展。此外，酪氨酸代谢对多种生物活性分子的产生至关重要，包括神经递质和激素，它们可以影响细胞信号传导和代谢过程[13]。酪氨酸代谢的改变与癌症的发展和进展有关，表明甲基化相关基因可能通过代谢重编程影响癌症 [14]。这些通路的识别强调了甲基化相关改变可能驱动膀胱癌发病机制并影响患者预后的潜在机制。
多因素Cox回归分析结果显示，肿瘤浸润、IGF2高表达与BLCA患者预后不良相关，VHL高表达与预后改善相关。肿瘤组织的浸润性生长模式是指肿瘤细胞通过侵袭周围组织，形成不规则的肿瘤边界。在膀胱癌中，肿瘤的浸润性生长模式与肿瘤的分期、转移及患者生存期显著相关，因此，肿瘤的浸润深度是膀胱癌预后评估的重要因素[15-17]。此外，肿瘤浸润性生长及晚期TNM分期与基因甲基化水平升高密切相关，此类患者常伴随生存率下降、复发风险增加，提示在肿瘤浸润患者中DNA甲基化可能作为独立不良预后因素参与疾病进展[18-20]。IGF2启动子区的低甲基化可能导致其转录活性增强，与IGF-1R结合后激活PI3K-AKT和MAPK通路，促进肿瘤细胞周期进展[21]，IGF2通过上调BCL-2家族蛋白抑制凋亡，增强肿瘤细胞存活，缩短患者生存期，导致预后不良[22]。已有研究发现，VHL基因作为肿瘤抑制基因，通过泛素化降解HIF-1α（缺氧诱导因子），抑制血管生成、糖酵解和细胞增殖[23]。VHL基因启动子区高甲基化可导致其转录沉默，降低VHL基因表达，使其丧失对VHL通路的调控能力，导致HIF的异常积累，从而促进肿瘤细胞的增殖和转移，影响患者的预后[24]。
免疫细胞浸润分析结果显示包括CD8+ T细胞、调节性T细胞和巨噬细胞在内的免疫细胞与鉴定的甲基化相关基因的表达显著相关。CD8+ T细胞对肿瘤细胞具有细胞毒性，其存在通常与各种癌症的更好预后有关[25]。相反，调节性T细胞可以抑制抗肿瘤免疫反应，可能导致较差的预后结果 [26]。肿瘤相关巨噬细胞则根据其极化状态，可表现出促肿瘤或抗肿瘤的特性[27]。甲基化相关基因与免疫细胞浸润之间的相关性表明，这些基因可能调节肿瘤免疫微环境，从而影响患者的预后 [28]。此外，与补体和凝血级联相关途径的富集，以及神经活性配体-受体的相互作用，进一步支持了这些基因在肿瘤微环境中调节免疫反应的作 用。
本研究也存在一定的局限性。研究样本量相对较小，可能影响结果的稳定性和泛化能力；研究基于回顾性数据，可能存在选择偏倚和混杂因素的影响，未来仍需在更大规模的多中心队列中验证这些甲基化基因的预后价值。本研究主要关注甲基化基因与预后的相关性，但未深入探讨其具体的分子机制，需通过功能实验（如基因敲除或过表达）进一步验证这些基因在膀胱癌发生和发展中的作用。
综上所述，本研究筛选了11个与BLCA预后显著相关的甲基化相关基因，并建立了预后模型，肿瘤浸润以及甲基化基因IGF2、VHL是与BLCA患者预后相关的独立预测因子。
伦理声明：不适用
作者贡献：研究构思与设计：路惠茹、李磊、殷锋彦、罗晓辉、吕军、李涛；论文撰写：路惠茹、耿辉；数据采集与分析、论文修订：耿辉、梁亮、张倩；经费支持、研究指导：吕军、李涛
数据获取：本研究中使用和（或）分析的数据可在https://portal.gdc.cancer.gov、https://www.genecards.org/获取
利益冲突声明：无
致谢：不适用
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