呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是呼吸道感染的常见致病病原体，婴幼儿、老年人及免疫低下人群为易感人群［1-2］。世界卫生组织数据显示，全球每年约10万名5岁以下儿童因RSV感染死亡，造成严重的公共卫生负担［3-4］。目前临床尚无特效抗病毒药物，仅能对症治疗，且国际上RSV疫苗种类稀少，我国暂无有效上市疫苗［5-7］。因此，加快构建完善的RSV研究体系，对提升临床诊疗水平与疾病防控能力具有重要现实意义。
当前临床相关研究依赖的人喉表皮样癌细胞（Hep-2）、猴肾细胞（Vero细胞）系及传统动物模型存在明显局限，无法准确模拟人体对RSV的应答，导致药物筛选、疫苗评价及致病机制研究结果可靠性不足，制约临床转化［8-10］。树鼩基因组与人同源性达93%，生理代谢特征高度相似，其细胞系已成功应用于多种人类病毒研究，显示出良好应用潜力［11-14］。血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）和血小板内皮细胞黏附分子-1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）是血管内皮细胞常用的经典标志物［15］。vWF主要由血管内皮细胞合成并储存，参与凝血及血小板黏附过程；CD31主要介导细胞间黏附及炎症反应，在维持血管内皮完整性中具有重要作用，二者常用于内皮细胞来源的鉴定与功能表征［16］。
本研究构建树鼩主动脉血管内皮细胞系（tree shrew aortic endothelial cell line，TSAEC），基于该细胞系开展RSV感染研究，并将其与树鼩其他组织来源的细胞进行比较研究，旨在为筛选RSV培养适宜的细胞基质提供基础数据，为建立更接近人类生理状态的RSV体外与体内研究体系提供实验依据，并为RSV疫苗研发、抗病毒药物筛选及致病机制研究提供新的模型平台。
1 材料与方法
1.1 实验动物
本研究使用的实验动物为12月龄的中缅树鼩，体重110~130 g，由中国医学科学院医学生物学研究所药物安全评价中心提供，实验动物生产许可证SCXK（滇）K2023-0003，使用许可证SYXK（滇）K2023-0008。动物饲养于中国医学科学院医学生物学研究所药物安全评价中心病原微生物安全实验室屏障环境内，环境条件为温度20~25 ℃，相对湿度40%~70%，昼夜节律为12 h光照/12 h黑暗循环，并提供充足的标准饲料及饮水。本研究获中国医学科学院医学生物学研究所伦理委员会审批（批号：DWSP2024008014）以及生物安全管理处审查（编号：SWAQ20240101）。
1.2 细胞系与病毒株
树鼩肺成纤维细胞（TSLFC）和树鼩血管平滑肌细胞（TSVSMC）均由本实验室分离转化，经过稳定传代和鉴定后保存于中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心［17］。Hep-2细胞来源于中国医学科学院医学生物学研究所钱兴丽老师惠赠并保存于本实验室。Vero细胞和RSV毒株A2株（ATCC VR-1540）均购自于美国ATCC，由中国医学科学院医学生物学研究所李倩倩博士惠赠给本实验室。上述细胞均在37 ℃、5% CO₂条件下培养，使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，并在常规条件下进行传代与维持培养。
1.3 主要试剂与仪器
主要试剂：胎牛血清（FBS，CellBox，中国）、DMEM/F-12培养基（VivaCell，中国）、RPMI 1640培养基（Thermo Fisher Scientific，美国）、CCK-8试剂盒（碧云天，中国）、病毒RNA提取试剂盒（QIAGEN，德国）、兔抗vWF单克隆抗体（ImmunoWay，美国）、鼠抗CD31单克隆抗体（GeneTex，美国）、兔抗SV40T单克隆抗体（Abcam，英国）、山羊抗兔IgG抗体（Abcam，英国）、山羊抗鼠IgG抗体（Abcam，英国）、RSV抗体（Abcam，英国）、一步法RT-PCR试剂盒（TaKaRa，日本）、双抗（青霉素-链霉素，Gibco，美国）、聚凝胺（Polybrene，Sigma-Aldrich，美国）、Triton X-100（Solarbio，中国）、牛血清白蛋白（BSA，Solarbio，中国）、DAPI染色液（碧云天，中国）、SV40T慢病毒（上海翌圣生物，中国）。
主要仪器：实时荧光定量PCR仪（CFX-950，BIO-RAD，美国）、细胞计数仪（TC20，Thermo Fisher，美国）、生物安全柜（1287，FORMA，美国）、二氧化碳恒温培养箱（CO2T/C，FORMA，美国）、倒置荧光显微镜（ECLIPSE Ti-S，Nikon，日本）。
1.4 研究方法
1.4.1 TSAEC细胞系构建
树鼩主动脉血管内皮原代细胞（primary TSAEC）的分离与培养：取12月龄健康雌性树鼩，腹腔注射1 mL的3%戊巴比妥钠麻醉处死后，在解剖台上迅速打开胸腔，用生理盐水进行心脏灌注。剪取主动脉弓段，用生理盐水冲洗，去除分支及外周结缔组织。纵向剪开血管，内膜外翻后剪成0.8~1.2 mm2小块，将组织小块贴附于T25培养瓶内壁（内膜侧接触瓶壁），静置5 min，随后，小心翻转培养瓶，使贴有组织块的一面朝上，加入1 mL含10% FBS和1%双抗的DMEM/F-12培养基，于37 ℃、5% CO₂培养箱中倒置培养20 min，以使组织块在未被培养基浸没的条件下充分贴壁。20 min后，缓慢翻转培养瓶，使培养基浸没组织块，继续培养12 h后补加3 mL完全培养基，此后每2 d换液1次。7 d后，血管内皮组织块周围细胞生长约80%汇合度时，用0.25%胰蛋白酶进行消化传代，连续传代3~5次，期间使用光学显微镜观察细胞形态。
取生长状态良好的primary TSAEC细胞，以2×105/mL密度接种于6孔板。待细胞融合度达80%以上时，用PBS清洗2次，每孔加入含4 μg/mL聚凝胺的维持培养基（DMEM/F-12，含2% FBS及1%双抗）1 mL。按感染复数（MOI）=30加入SV40T慢病毒，同时设置未感染慢病毒的原代TSAEC作为对照（仅加入相同体积含聚凝胺的维持培养基，不加入病毒）。培养4 h后补加等体积含聚凝胺的维持培养基，继续培养24 h后，更换为不含巨凝胺改为：含4 g/mL嘌呤霉素的完全培养基（DMEM/F-12，含10% FBS及1%双抗）培养24 h。每2 d换液一次。待对照孔细胞全部死亡后，将存活的转染细胞用完全培养基继续培养，并连续传代50代以上。
1.4.2 免疫荧光检测细胞表面标志物及RSV
取生长状态良好的细胞，消化传代48 h后，待细胞融合度约80%时进行固定。弃去培养基，用PBS冲洗1次，加入4%多聚甲醛室温固定20 min。PBS漂洗3次（每次3 min）后，加入0.5% Triton X-100穿孔20 min，再次使用PBS清洗3次。随后用2% BSA室温封闭30 min，PBS漂洗。加入稀释好的CD31、vWF和RSV一抗（1∶500），4 ℃孵育过夜后，PBS充分漂洗3次，在避光条件下加入相应二抗，37℃孵育60 min。PBS漂洗后，加入DAPI染色液避光孵育2 min以标记细胞核，最后用PBS清洗3次。于荧光显微镜下观察并采集图像。
1.4.3 细胞生长活力检定
制备细胞悬液接种在96孔培养板中，接种浓度为5×104/mL，每孔100 μL，同时设置实验组和空白组，每组3个复孔，置于37 ℃、5% CO2温箱中培养，每天同一时间点取出培养板，吸除培养基并用PBS清洗2次后，每孔加入10 μL CCK-8试剂混合液（培养基：CCK-8试剂=9∶1），继续培养30 min。使用酶标仪测定450 nm波长的吸光度值（OD值），连续测量7 d，以实验组OD值减去空白组OD值后的校正值绘制细胞生长曲线。
1.4.4 RSV感染TSAEC细胞
将生长状态良好的TSAEC以2×106/mL密度接种于T25培养瓶，培养48 h后，细胞融合度达80%以上。PBS清洗细胞2次，按MOI=0.1接种RSV，37℃吸附50 min后，弃病毒液，加入4 mL维持培养基继续培养。每日观察细胞病变效应（cytopathic effect，CPE），约80%细胞出现典型病变时终止培养。将培养瓶密封后于-80 ℃冷冻3 h，室温解冻，反复冻融2次。收集培养物，12 000 rpm离心8 min，取上清即为病毒收获液。用相同的病毒和方法感染TSLFC、TSVSMC、Hep-2和Vero细胞。
1.4.5 RT-qPCR检测RSV病毒载量
将TSAEC及对照细胞（TSLFC、TSVSMC、Hep-2、Vero）以2×105/孔的密度接种于12孔板，培养至融合度约80%后，按MOI=0.1接种RSV病毒。分别于感染后12、24、48、72、96、120 h收集样品。向细胞中加入裂解液充分裂解，离心后收集上清液用于RNA提取；收集细胞培养上清液，离心去除细胞碎片后取上清备用。使用病毒RNA提取试剂盒提取总RNA。采用一步法RT-qPCR试剂盒检测病毒载量，反应程序为：42 ℃ 30 min（反转录）；95 ℃ 2 min（预变性）；95 ℃ 5 s、58 ℃ 30 s，共40个循环。以无模板对照为阴性对照，根据各时间点病毒RNA拷贝数绘制病毒增殖曲线。所用引物及探针针对RSV核蛋白基因保守区域设计，见表1。
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表格1 探针和引物序列
Table1.Probe and primer sequences
1.4.6 用TSAEC检测RSV病毒滴度
将本研究建立的TSAEC细胞以5×104/孔的密度接种于96孔板，培养至细胞铺满。RSV感染细胞后继续培养，收集感染后培养上清液作为病毒收获液，经反复冻融2次后，3 000 rpm离心10 min以去除细胞碎片，取上清备用。将病毒收获液用维持培养基进行10倍梯度稀释，每个稀释度接种8个复孔，每孔100 μL，以未接种病毒细胞做对照。培养7 d，每日观察并记录CPE。采用Reed-Muench法计算半数组织培养感染剂量（TCID50），计算公式为：TCID50=10［a+x（b-a）］，其中a为高于50%感染率的稀释度的对数，b为低于50%感染率的稀释度的对数，x=（高于50%的感染率-50%）/（高于50%的感染率-低于50%的感染率）。
1.5 统计学分析
使用SPSS 18.0软件进行数据分析，并采用GraphPad Prism 8.0软件绘图。2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 primary TSAEC的形态学观察
分离培养获得的primary TSAEC在培养至第9天时，可观察到细胞呈放射状从组织块边缘迁出并活跃增殖，贴壁面积达到约80%（图1-A）。经消化传代后，细胞在P2代即呈现均一、典型的扁平梭形内皮细胞形态，且生长状态良好（图1-B）。P4代可见细胞形态均一，细胞间连接紧密，进一步证明该细胞在体外培养中的稳定性（图1-C）。
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图1 TSAEC不同代次细胞形态观察
Figure1.Morphological observation of TSAEC at different passages
注：A.原代TSAEC培养（P0）第9天形态学观察；B.TSAEC第2代（P2）形态学观察；C.TSAEC第4代（P4）形态学观察。
2.2 TSAEC连续稳定传代培养
为解决primary TSAEC细胞的传代有限性问题，通过慢病毒载体向该原代细胞内转染SV40T基因，成功构建TSAEC细胞系。形态学观察显示，与早期代次P10（图2-A）、P32（图2-B）相比，P60代细胞仍稳定保持典型的扁平梭形内皮细胞形态，细胞形态基本一致，未观察到明显异常形态学改变（图2-C）。通过CCK-8法检测细胞增殖活力发现，P10、P32与P60代细胞均在培养中期进入对数生长期，且P32与P60代细胞的增殖能力与P10代相比无显著差异（图2-D），表明该细胞系在长期传代后仍维持旺盛的增殖活性，具备连续传代的稳定性。
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图2 树鼩主动脉血管内皮细胞系TSAEC不同传代细胞形态及细胞活力变化
Figure2.Morphological observation and cell viability of TSAEC at different passages
注：A.TSAEC第10代（P10）形态学观察；B.TSAEC第32代（P32）形态学观察；C.TSAEC第60代（P60）形态学观察；D.CCK-8法检测TSAEC不同代次细胞活力。
2.3 免疫荧光鉴定TSAEC内皮细胞特异性标志物
细胞免疫荧光实验结果显示，建立的稳定传代细胞系TSAEC能高表达内皮细胞特异性标志物vWF与CD31，且荧光信号清晰定位于细胞质与细胞膜（图3），表明TSAEC能保持组织细胞表达特性，为其病毒易感性奠定了重要分子基础。
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图3 免疫荧光检测TSAEC细胞vWF和CD31的表达
Figure3.Detection of vWF and CD31 expression in TSAEC by immunofluorescence
2.4 TSAEC对RSV的高度易感性
使用RSV感染TSAEC及对照细胞（TSLFC、TSVSMC、Hep-2和Vero），形态学观察发现感染病毒2 d后，TSAEC中合胞体形成现象最为显著。感染5 d后，TSLFC和TSVSMC细胞均出现大量死亡，Hep-2细胞及Vero细胞也表现出明显感染迹象（图4）。在相同观察时间条件下，TSAEC的CPE出现最早且病变最为显著。
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图4 不同细胞感染RSV病毒后CPE观察
Figure4.Observation of CPE in various cells after infection with RSV
注：dpi.感染后天数。
2.5 RT-PCR检测TSAEC细胞内的RSV病毒载量
通过RT-qPCR检测结果发现在相同MOI下，RSV在TSAEC细胞中的最终病毒产量与整体复制效率优于其他对照细胞系（图5）。尽管在感染早期（0~48 hpi），Hep-2细胞中的病毒载量略高于TSAEC，但TSAEC表现出更强的持续复制能力；自72 hpi起，其病毒载量迅速上升并反超，在96~120 hpi达到峰值（7.8 × 107 copies/mL），该峰值水平显著高于包括Hep-2、Vero、TSVSMC及TSLFC细胞（P < 0.01）。
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图5 不同细胞感染RSV病毒后不同时间下病毒载量检测
Figure5.Viral load in various cells at different time points post-RSV infection
注：hpi.感染后小时数；**P < 0.01。
2.6 免疫荧光检测TSAEC细胞内RSV复制
免疫荧光结果显示TSAEC细胞胞质内呈现显著的病毒抗原信号，DAPI染色显示合胞体区域存在多核聚集，证实RSV感染可诱导典型细胞融合（图6），TSAEC可作为RSV研究的重要细胞系。
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图6 免疫荧光观察TSAEC细胞中RSV病毒复制
Figure6.Immunofluorescence observation of intracellular RSV replication in infected TSAEC
2.7 TSAEC细胞应用于RSV的滴度检测
病毒滴度测定显示，在10-5及更低稀释度（即病毒浓度较高）时，所有8个复孔细胞均完全病变。用10⁻⁶稀释度（临近终点稀释度）接种后第7天进行观察，发现TSAEC呈现出典型CPE，包括细胞圆缩、脱落以及合胞体形成，细胞病变情况如表2和图7所示。按照Reed-Muench法计算病毒滴度，每孔加入病毒体积为100 μL，计算出病毒滴度为107.5 TCID50/mL，说明RSV在TSAEC细胞中可以维持较强的感染活力。
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表格2 RSV在TSAEC上的滴度测定
Table2.Titration of RSV on TSAEC
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图7 RSV病毒10-6稀释梯度感染8复孔细胞病变情况（7dpi）
Figure7.Cytopathic effect in 8 replicate wells infected with RSV at a 10-6 dilution (7 dpi)
注：10⁻⁶稀释梯度下，8个复孔中1~6孔出现明显CPE（合胞体现象），7~8孔无明显病变。
3 讨论
RSV作为全球范围内引起婴幼儿下呼吸道感染的重要病原体［5，7，18］，其疫苗与特效药物的研发瓶颈源于缺乏能够精准模拟人体感染生理与病理过程的实验模型［5-6］。现有动物模型（如棉鼠、啮齿类）在免疫系统、呼吸道解剖结构及疾病表现上与人类存在本质差异［19-21］。而常用细胞系（如Hep-2、Vero）则因其癌源属性或有限的病毒产能，难以完全再现自然感染中病毒与宿主细胞的复杂过程［8-9］。因此，开发源于更接近人类物种、生理功能更完整的体外细胞模型，是深化RSV机制研究并突破转化瓶颈的关键路径。本研究聚焦于与人类亲缘关系较近的树鼩，成功构建并系统评价了TSAEC作为RSV高效感染模型的适用性，为RSV的病原-宿主相互作用研究及抗病毒策略开发提供了新的、更具生理相关性的体外模型。
本研究证实永生化TSAEC对RSV具有高度易感性，且其介导的病毒复制效率显著优于同源的TSLFC和TSVSMC细胞，展现出明显的血管内皮亲嗜性［22-23］。这一现象的分子机制可能涉及内皮细胞特异性表达的介导受体以及独特的胞内微环境。已有研究表明，RSV表面的糖蛋白（G蛋白）可通过其保守的CX3C结构域［24-25］，特异性地与宿主细胞表面的Fractalkine受体（CX3CR1）相互作用，从而高效介导病毒的吸附与入侵［26-27］；而血管内皮细胞在生理状态下高表达CX3CR1，为RSV的高效吸附提供了丰富的分子靶点［28］。此外，血管内皮细胞膜表面富含脂筏结构，且具备活跃的网格蛋白/小泡介导的内吞途径，该特征可显著加速RSV的脱壳与基因组释放［29］。更为重要的是，内皮细胞内部的固有免疫应答阈值可能存在独特的负调控机制，构建了有利于病毒基因组高通量复制、装配与释放的胞内微环境，解释了TSAEC中病毒滴度峰值可达107.5 TCID50/mL的内在原因［30］。
与临床常用工具细胞Hep-2比较，TSAEC表现出不同的病毒复制动力学特征及宿主细胞响应模式。Hep-2细胞来源于喉癌上皮，其基因表达谱、细胞信号通路及表面受体组成已发生转化性改变［31］。本研究结果显示，Hep-2细胞在RSV感染早期具有较高的病毒复制效率，但随着感染进程推进，细胞迅速出现CPE并发生死亡，从而限制病毒后续复制及持续释放。相比之下，来源于正常血管组织的TSAEC在感染过程中保持相对稳定的细胞活性和较完整的细胞结构，为RSV完成持续复制、组装及释放提供了更适宜的细胞内环境。因此，在感染中后期（72~120 hpi），TSAEC可维持较高水平的病毒载量。该结果提示，与肿瘤来源细胞相比，TSAEC在模拟RSV与正常宿主细胞相互作用方面具有一定优势，可为研究病毒复制规律、宿主响应机制及抗病毒干预提供更具生理相关性的体外模型。
本研究存在一定局限性。首先，本研究主要进行TSAEC体外水平的验证，该细胞系在支持RSV临床分离株感染方面的表现尚不明确，其在共培养体系或类器官模型中的应用价值也尚待进一步验证。此外，利用TSAEC制备RSV病毒液并建立树鼩感染模型的可行性，仍有待后续研究探索。
综上，本研究成功构建了树鼩来源的TSAEC细胞系，并验证了该细胞系作为RSV高效复制模型的价值。这一模型兼具“物种近似性”（树鼩）与“细胞类型针对性”（血管内皮），突破了传统模型的若干局限，为RSV的基础生物学研究、抗病毒药物评价及疫苗免疫原性测试提供了新的、强有力的体外工具。同时，该成果也为后续构建树鼩RSV感染动物模型，开展体内发病机制、免疫保护及病理学研究奠定了细胞学与理论基础，有望推动RSV研究领域向更贴近人类疾病的方向发展。
伦理声明：本研究获中国医学科学院医学生物学研究所伦理委员会审批（批号：DWSP202408014）
作者贡献：研究设计、指导与论文审定：陆彩霞、赵远；实验操作、数据采集与分析：李娜、王文广、范胜涛、曾庆巍、沈丽娟；论文撰写：李娜、王文广
数据获取：本研究中使用和（或）分析的数据可联系通信作者获取
利益冲突声明：无
致谢：向在北京协和医学院中国医学科学院医学生物学研究所实验过程中给予悉心指导与技术协助的老师和同学们表示最诚挚的谢意
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