全球癌症统计数据显示，肺癌是导致癌症死亡的首要原因［1］。我国肺癌患者5年生存率仅为19.7%，但早期识别并行肺叶切除术可使ⅠA期肺癌患者术后5年生存率提高至90%［2-3］。低剂量螺旋CT是早期肺癌筛查的常见方法，但其假阳性率高，易造成过度诊疗，加重患者身心与经济负担［4］。对于肺部可疑病灶，支气管镜活检为临床病理诊断的金标准，但受病灶位置、体积及操作水平等多重因素限制，支气管镜活检对外周肺结节的诊断敏感度仅为18%~62%［5］。此外，常规血清肿瘤标志物存在敏感度与特异度不足等局限，难以满足早期筛查需求［6-7］。因此，临床亟需一种高效、精准的新型生物标志物，为早期肺癌的精准诊断提供可靠依据。
DNA甲基化作为一种表观遗传修饰，广泛参与恶性肿瘤发生和进展的早期调控过程，可作为恶性肿瘤早期诊断的生物标志物［8-9］。矮小同源盒基因2（short stature homeobox 2，SHOX2）与RAS关联域家族蛋白1A（RAS association domain family 1A，RASSF1A）启动子区域的甲基化状态，是目前肺癌诊断及预后评估领域研究最为广泛的生物标志物［10-12］。然而，基于表观遗传的甲基化诊断标志物，易受遗传和环境变化的影响［9-10］。怀化地区处于湖南省西部，苗族、侗族、土家族等多个少数民族在此聚集，地理环境、饮食及行为习惯等与其他地区存在显著差异。基于此，本研究纳入怀化地区因肺部病变就诊的患者为研究对象，通过检测支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中SHOX2、RASSF1A基因甲基化水平，评估DNA甲基化在该地区肺癌患者早期诊断和预后评估中的价值。
1 资料与方法
1.1 研究对象
选取2020年11月至2023年6月于怀化市肿瘤医院行支气管镜检查的患者为研究对象，回顾性分析患者临床资料。纳入标准：①年龄18~85岁；②常规剂量CT或三维重建发现有肺部病变，描述为肺结节、占位或阴影性病变等；③具有1年以上随访信息；④能够充分理解知情同意书内容。排除标准：①术中不耐受内镜检查或未完善病理检查；②支气管灌洗液样本不合格；③合并其他部位原发肿瘤。本研究经怀化市肿瘤医院伦理委员会审批（批号：HHSEYYEC-202111-K1-修正案审查1）。
根据病理检查结果，将研究对象分为肺癌组和对照组。
1.2 资料收集
通过电子病历系统收集患者临床资料，包括年龄、性别、民族、吸烟史、肿瘤分期、组织学亚型、分化程度以及肿瘤直径等。肿瘤分期按照国际肺癌研究协会制订的第8版国际肺癌TNM分期标准确定［13］。
1.3 BALF采集
由呼吸科副主任及以上医师操作，将60 mL灭菌生理盐水分3次注入病变肺段，停留20 s后负压抽吸，回收量 ≥ 20 mL，随后刷检或钳取组织行病理学检查。
1.4 DNA提取与亚硫酸盐修饰
取BALF 10 mL，10 000 rpm离心5 min，弃去上清液，采用天根生化科技（北京）有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（DP304-03）进行DNA提取。DNA亚硫酸盐修饰过程按照Zymo Research生物科技公司的 EZ DNA Methylation-DirectTM Kit试剂盒说明书操作。
1.5 荧光定量PCR
修饰后的DNA采用SHOX2、RASSF1A基因甲基化DNA检测试剂盒（PCR荧光法）（上海透景生命科技股份有限公司，国械注准：20173403354）检测。阳性判读标准为：FAM荧光信号的扩增曲线为光滑S形，且Ct值 < 35，提示RASSF1A基因甲基化阳性；VIC或HEX荧光信号的扩增曲线为光滑S形，且Ct值 < 32，提示SHOX2基因甲基化阳性。SHOX2/RASSF1A阳性：SHOX2和RASSF1A基因甲基化联合检测任一阳性；SHOX2+RASSF1A阳性：SHOX2和RASSF1A基因甲基化联合检测均阳性。
1.6 统计学分析
采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 9软件进行统计分析与图表绘制。计数资料采用例数和百分比（n，%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Kappa法分析PCR检测和组织病理学检测结果的一致性，采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线及其曲线下面积（area under curve，AUC）评估各指标的诊断效能。既往研究表明，肿瘤直径是肺癌患者的独立预后因素［14］。据此，采用Kaplan-Meier曲线和Log-rank检验评估不同肿瘤直径和DNA甲基化水平患者组间生存差异。单因素Cox回归分析初步筛选生存状况的影响因素，将P < 0.1的变量纳入多因素Cox比例风险模型最终筛选；P < 0.05为差异有统计学意义。总生存期（overall survival，OS）定义为入组至死亡的时间，若患者末次随访时仍然存活，则以末次随访时间（2025年3月15日）作为OS终点。
2 结果
2.1 一般情况
共纳入108例研究对象，肺癌组68例、对照组40例。两组患者在年龄、性别、民族、吸烟史等一般资料上差异无统计学意义（P > 0.05），见表1。
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表格1 肺癌组与对照组一般资料（n，%）
Table1.General characteristics of the lung cancer and control groups (n, %)
2.2 一致性检验
PCR检测BALF中SHOX2和RASSF1A基因甲基化水平，并与组织病理活检结果对比。68例肺癌组患者中SHOX2、RASSF1A基因甲基化阳性55例，40例对照组患者中甲基化阳性2例，提示甲基化检测与病理活检一致性较高，可用于肺癌诊断［Kappa=0.718，95%CI（0.589，0.847）］。
2.3 不同肿瘤分期诊断敏感性分析
SHOX2/RASSF1A阳性在不同分期肿瘤中的诊断敏感性高于SHOX2、RASSF1A单一阳性，也高于SHOX2、RASSF1A联合阳性；其中，SHOX2在肿瘤Ⅰ期患者中的敏感性较高，与SHOX2/RASSF1A检测结果一致，高于RASSF1A的敏感性，提示SHOX2甲基化对早期肺癌具有一定的诊断价值，见附件表1。
2.4 不同组织学亚型诊断敏感性分析
SHOX2、RASSF1A甲基化在不同组织学亚型肿瘤中的诊断敏感性稍有差异。SHOX2/RASSF1A甲基化阳性对肺鳞癌和小细胞肺癌亚型敏感性较好，高于肺腺癌；进一步分析发现，肺鳞癌、小细胞肺癌中SHOX2/RASSF1A的诊断能力主要基于SHOX2甲基化阳性，敏感性达92.0%、93.3%，见附件表2。
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表格2 影响OS的单因素与多因素分析［HR（95%CI）］
Table2.Univariate and multivariate analysis of factors affecting OS [HR (95%CI) ]
2.5 诊断效能分析
ROC曲线结果显示，SHOX2、RASSF1A单一阳性的AUC值分别为0.865［95%CI（0.793，0.937）］和0.723［95%CI（0.629，0.817）］，SHOX2/RASSF1A阳性的AUC值为0.879［95%CI（0.811，0.948）］，其中敏感性为80.9%，特异性为95.0%，提示SHOX2/RASSF1A阳性在肺癌中具有较高的诊断价值，见附件图1、附件表3。
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图1 肺癌患者生存曲线分析
Figure1.Kaplan-Meier survival curves of lung cancer patients
注：A.SHOX2甲基化结果分组生存曲线；B.RASSF1A甲基化结果分组生存曲线；C.SHOX2+RASSF1A阴性与SHOX2、RASSF1A单阳或双阳性组生存曲线；D.肿瘤直径分组生存曲线；E.肿瘤直径与RASSF1A甲基化联合分组生存曲线；F.肿瘤直径与SHOX2/RASSF1A甲基化联合分组生存曲线，其中肿瘤直径 > 5 cm、SHOX2+RASSF1A阴性组仅1例。
2.6 预后价值分析
截至末次随访，肿瘤组尚有11例患者存活。Kaplan-Meier曲线显示，SHOX2、RASSF1A甲基化阳性患者生存率显著低于SHOX2、RASSF1A甲基化阴性患者（P < 0.01），见图1-A和1-B；SHOX2/RASSF1A甲基化阳性患者生存率低于SHOX2、RASSF1A均阴性患者（P < 0.05），但SHOX2/RASSF1A阳性与SHOX2+RASSF1A阳性对肺癌患者预后的影响无明显区别，见图1-C。本研究还发现肿瘤直径 > 5 cm的患者生存率明显低于肿瘤直径 ≤ 5 cm的患者（P < 0.001）。肿瘤直径和DNA甲基化联合分析表明，肿瘤直径 ≤ 5 cm且RASSF1A甲基化阴性患者生存率明显优于RASSF1A甲基化阳性患者，提示RASSF1A甲基化阳性是判断肺癌患者预后的优良指标（P < 0.001）；进一步分析显示，肿瘤直径 ≤ 5 cm且SHOX2+RASSF1A甲基化阴性患者生存率显著高于肿瘤直径 > 5 cm且SHOX2/RASSF1A阳性患者（P < 0.001），见图1-D至1-F。
2.7 肺癌患者OS危险因素分析
单因素Cox回归分析显示年龄、吸烟史、肿瘤分期、分化程度、病理类型、SHOX2/RASSF1A等与肺癌患者OS相关，将其纳入多因素Cox回归模型，结果显示肿瘤III-IV期［HR=8.921，95%CI（1.823，43.655）］、低分化［HR=3.493，95%CI（1.487，8.204）］、小细胞肺癌［HR=2.620，95%CI（1.044，6.574）］是OS的独立危险因素，见表2。
3 讨论
DNA甲基化是驱动恶性肿瘤发生发展的重要表观遗传修饰［15］。研究发现，肺癌中多个基因呈局灶高甲基化状态，其中抑癌基因启动子区域甲基化对肺癌的发生和进展具有显著影响［16］。因此，对外周血、痰液等体液标本中DNA甲基化状态检测，在肺癌早期筛查与诊断中具备重要临床应用价值［17-18］。
本研究结果显示，PCR检测BALF中SHOX2/RASSF1A甲基化水平诊断肺癌与组织病理学检查结果一致性较高（Kappa=0.718）。亚组分析发现，SHOX2/RASSF1A对中晚期患者的诊断敏感性明显高于早期患者，与唐华等［19］研究结果一致，可能与晚期肺癌侵袭性更强，DNA甲基化水平更高有关。在II期患者中，SHOX2、RASSF1A单独应用的敏感性分别为60.0%和40.0%，联合应用则提升至80.0%。有研究表明，BALF中SHOX2甲基化是早期肺癌诊断的高敏感性指标，SHOX2甲基化在Ⅰ期肺癌的阳性率（78.6%）显著高于RASSF1A阳性率（28.6%）［20-22］。本研究中SHOX2在I期肿瘤的敏感性为50.0%，高于RASSF1A。此外，一项TCGA数据库队列分析证实SHOX2甲基化在III~IV期肺癌中无显著升高，提示SHOX2可能是早期肺癌而非进展期肺癌的诊断标志物［23］。抑癌基因RASSF1A与肺癌的TNM分期和淋巴结转移存在显著相关性，广泛参与肺癌的侵袭、转移等生物学过程［24］。RASSF1A基因高甲基化可在不同分期肺癌中检测到，特异度较高，但存在敏感性不足的问题［25］。基于两基因在肺癌中敏感性和特异性的不同优势，SHOX2、RASSF1A联合应用更具备作为早期肺癌诊断分子标志物的应用潜力，后续可进一步探索与传统肿瘤标志物、低剂量螺旋CT联用的诊断效能，以期改善临床早期肺癌诊断中假阳性与假阴性偏高的现状。
组织学亚型分析显示，SHOX2和RASSF1A甲基化在小细胞肺癌和鳞癌中的诊断敏感性较好，优于腺癌，与Ren等［20］研究结果一致。可能与小细胞肺癌和鳞癌多为中央型病灶，肿瘤细胞及其标志物更易释放至BALF有关［26］。预后分析显示，SHOX2、RASSF1A甲基化状态与肺癌患者生存率显著相关（P < 0.05）。单因素回归分析表明，2种基因甲基化均为肺癌预后的相关危险因素，但多因素Cox分析显示，SHOX2、RASSF1A甲基化并非肺癌患者的独立预后因子（P > 0.05），而肿瘤分期、分化程度以及病理类型仍是影响预后的独立危险因素。不同病理类型肺癌的预后及治疗方案存在异质性，在校正病理类型、肿瘤分期等变量后，2种基因甲基化的预后独立预测价值被明显削弱，提示其预后作用可能受临床病理特征混杂调控。综上，尽管SHOX2、RASSF1A甲基化并非肺癌独立预后因素，但其在单因素模型中与生存预后显著关联，提示二者参与肺癌恶性进展进程，可为临床个体化治疗方案制定提供参考依据［27］。
本研究存在一定局限性。首先，研究样本量较小，I~II期患者占比较少，难以确定SHOX2/RASSF1A对早期肺癌的诊断效能，后续仍需进一步扩大验证；其次，表观遗传修饰受基因、饮食习惯及环境等多因素调控，本研究探索了民族差异对SHOX2、RASSF1A甲基化水平的影响，结果显示差异无统计学意义，可能与样本中少数民族占比较少，亚组分析的统计效力不足有关，后续研究值得扩大样本量进一步探索。
综上，SHOX2/RASSF1A甲基化检测在肺癌诊断中与组织病理学方法一致性较强，具有作为早期肺癌诊断生物标志物的潜力，SHOX2/RASSF1A甲基化水平与肺癌患者的生存预后存在相关性。
附件见《医学新知》官网附录（https://yxxz.whuznhmedj.com/futureApi/storage/appendix/202510121.pdf）
伦理声明：本研究经怀化市肿瘤医院伦理委员会审批（批号：HHSEYYEC-202111-K1-修正案审查1）
作者贡献：实验设计：何韶华；临床检查操作、数据收集、随访：张田慧、蒋丽、贺志辉；数据分析、作图：周琴、谢文霞；样本检测：陈成；临床病例入组：刘仁水；病理诊断：余鹏飞；论文撰写：何韶华、周琴；研究指导、论文审定、经费支持：谭力铭
数据获取：本研究中使用和（或）分析的数据可联系通信作者获取
利益冲突声明：无
致谢：感谢本次科研及论文写作过程中科室同事的支持
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