目的  探索锚蛋白重复序列22（ANKRD22）在胰腺癌（PC）中的表达、临床预后分析和对PC细胞表型的影响。

方法  使用R语言和Perl语言分析TCGA-PC和GEO数据库中ANKRD22的表达水平及其对PC预后的影响。利用siRNA构建ANKRD22干扰的PANC-1和AsPC-1细胞系模型。利用CCK-8法、克隆形成、Transwell实验检测细胞增殖和侵袭能力，利用流式细胞术检测ANKRD22敲低对细胞凋亡的调控作用。

结果  与正常胰腺组织相比，PC组织ANKRD22表达量明显升高，高表达ANKRD22的患者总生存期明显低于低表达ANKRD22的患者，并与不良预后相关。敲低ANKRD22后PC细胞增殖和侵袭能力明显减弱，但不影响细胞凋亡。

结论  ANKRD22在PC中高表达并促进PC细胞增殖和侵袭，ANKRD22可能是治疗PC的重要靶点之一。

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是常见的消化道肿瘤之一，随着生活水平的提高，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势[1]。手术切除是早期PC最佳的治疗方式之一，然而由于疾病的隐匿性，绝大多数患者确诊时已处于晚期。放化疗是晚期和不可切除PC最主要的治疗方式[2]。以吉西他滨为主导的化疗方案能够一定程度上延长PC患者的总生存期（overall survival，OS），但效果有限[3]。本研究团队前期通过分析SEER数据库发现放疗能够显著改善不可切除PC患者的OS，但仍缺乏大样本前瞻性研究进一步证实[4]。靶向治疗和免疫治疗可能为个体化PC患者带来新的治疗策略，但其研究进展缓慢[5-6]。早期筛查困难和缺乏靶向药物是PC治疗的难点，因此探索PC新的标志物和治疗靶点具有重要意 义。

锚蛋白重复序列（ankyrin repeat domain，ANKRD）蛋白在哺乳动物中广泛存在，参与调节细胞生理功能，包括维持细胞骨架完整性、介导离子转运及肿瘤发生等[7]。ANKRD22是一种功能尚未明确的锚蛋白家族成员，包含4个ANKRD，由191种氨基酸组成。研究发现ANKRD22在部分肿瘤中高表达，并参与早期肿瘤的复发和转移 [8]。ANKRD22在PC中的表达和功能尚不明确。本研究通过挖掘TCGA数据库并结合细胞表型实验，探讨ANKRD22在PC的表达、预后和对肿瘤细胞的调控作用。

1 材料与方法

1.1 数据来源

泛癌数据分析来源于TIMER2.0数据库（http://timer.comp-genomics.org/），人PC转录组和临床数据来源于TCGA-PC（http://portal.gdc.cancer.gov）和GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），使用R语言和Perl语言进行数据分析。免疫组化图来源于HPA数据库（http://proteinatlas.org）。

1.2 材料

人PC细胞系PANC-1和AsPC-1来源于美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），由空军特色医学中心实验室保存。siRNA由北京天一辉远生物科技有限公司合成。DMEM完全培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS）、RNAiMAX、ANKRD22多克隆抗体（PA5-71839）、兔抗人IgG抗体（A18903）及β-actin多克隆抗体（PA1-183）购自美国ThermoFisher公司。1%青霉素-链霉素溶液（P/S）、0.25%胰酶购自北京阳光英锐生物科技有限公司。CCK8试剂盒购自日本DOJINDO公司。Transwell小室购自美国Corning公司。Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自上海翌圣生物科技有限公司。

1.3 细胞培养和转染

PANC-1细胞系生长于含有10% FBS和1% P/S的DMEM培养基中，AsPC-1细胞系生长于含有10% FBS和1% P/S的RPMI-1640培养基中。细胞放置于5% CO_2、37 ℃恒温培养箱中。当细胞生长至90%时使用0.25%的胰酶消化并传代，选择处于对数生长期的细胞进行实验。

待6 cm皿中的细胞生长至70%进行转染，细胞用0.25%胰酶消化后处于悬浮状态。配置转染试剂（10 μL RNA iMAX+490 μL DMEM）和敲低试剂（10 μL siRNA+490 μL DMEM），将转染试剂和敲低试剂混匀后静置20 min，随后加入到细胞中，8 h后换液，72 h后取部分细胞验证敲低效果，并进行后续的细胞功能试验。

1.4 蛋白免疫印迹实验

细胞消化离心后加入2倍体积的RIPA裂解液提取蛋白，加入RIPA等量的2×SDS后沸水煮15 min使蛋白充分变性，随后进行蛋白电泳。蛋白转至硝酸纤维素膜后用5%脱脂牛奶封闭1 h，室温下孵育一抗（ANKRD22多克隆抗体1 ∶ 1 000稀释、β-actin多克隆抗体1 ∶ 2 000稀释）和二抗（兔抗人IgG抗体1 ∶ 10 000稀释），使用Bio-Rad显影仪显影（美国伯乐）。

1.5 CCK-8实验

选取处于对数生长期的细胞进行实验。细胞消化后呈悬浮液，计数后接种于96孔板，每孔约3 000个细胞，设置三个复孔。细胞贴壁后每孔加入配制含10% CCK-8试剂的培养基，细胞培养箱中孵育2 h，随后酶标仪测定450 nm的吸光度值（OD），于第1、2、3、4天同一时间按上述步骤进行测量。

1.6 细胞克隆形成实验

选取处于对数生长期的细胞进行实验。细胞消化并计数，于3.5 cm培养皿中接种500个细胞，继续培养14 d，多聚甲醛固定后结晶紫染色，拍照并计数。

1.7 细胞侵袭实验

选取处于对数生长期的细胞进行实验。细胞消化并用无FBS、无P/S的培养基悬浮，细胞计数后调整密度至2.5×105/mL，在Transwell下室中加500 μL含10% FBS的培养基，上室中加入200 μL细胞悬液。细胞培养箱孵育24 h，多聚甲醛固定后用结晶紫染色，显微镜下观察并计数。

1.8 细胞凋亡实验

按凋亡试剂盒说明书进行操作，细胞消化后用PBS洗涤。使用结合液重悬细胞，分别加入5  μL Annexin V-FITC 和10 μL PI 染色液，轻轻混匀。室温避光孵育10 min，流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。

1.9 统计学分析

使用 SPSS 23.0软件进行数据分析，GraphPad Prism8.0软件进行图形绘制。计量资料采用均数和标准差（）表示，使用t检验对两组间数据进行统计学分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ANKRD22在泛癌中的表达情况

为探索ANKRD22在不同肿瘤及癌旁组织的表达情况，在泛癌数据库TIMER2.0中提取了ANKRD22基因在泛癌中的表达差异柱状图。可见ANKRD22在多种肿瘤中表达增高，如乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结肠癌、胶质瘤、肺癌、PC、直肠癌、甲状腺癌和子宫内膜癌等（图1）。

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  图1 ANKRD22在泛癌中的表达情况

  Figure1.The expression of ANKRD22 in pan-cancer

  注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

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2.2 ANKRD22在PC中的表达和临床预后分析

比较TCGA-PC数据库中癌和癌旁组织的差异基因，ANKRD22在肿瘤组织中高表达（图 2-A）。 将肿瘤患者按ANKRD22表达水平中位数分为高表达和低表达ANKRD22组后绘制生存曲线，结果显示高表达ANKRD22的患者OS小于低表达组（图 2-B）。单因素分析显示，ANKRD22的表达水平是影响PC预后的独立因素[HR=1.392，95%CI（1.121，1.729），P＜0.05]（图 2-C）。多因素分析同样表明ANKRD22基因可作为PC独立的预后因子[HR=1.441，95%CI（1.176，1.765），P＜0.05]（图2-D）。

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  图2 ANKRD22在PC中的表达和临床预后分析

  Figure2.Expression and clinical prognosis analysis of ANKRD22 in pancreatic cancer

  注：A.TCGA数据库中ANKRD22在PC和癌旁的表达；B.TCGA数据库中ANKRD22的表达对PC预后的影响；C.ANKRD22的单因素独立预后分析；D.ANKRD22的多因素独立预后分析；*P＜0.05。

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为了进一步验证ANKRD22在PC中的表达和预后情况，从GEO数据库中选择了两个PC生存数据集（GSE62452和GSE183795）。其中，GSE62452数据集包括69例PC和相邻的非肿瘤组织的基因表达谱，GSE183795数据集包括139例PC患者的胰腺肿瘤组织、102例相邻非肿瘤组织以及3例正常胰腺组织的微阵列基因表达谱。分别整理两个数据集RNA表达数据和临床数据，发现ANKRD22在肿瘤组织中均为高表达（图 3-A和图3-B），且高表达ANKRD22的患者OS小于低表达ANKRD22的患者（P＜0.05，图3-C和图 3-D）。

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  图3 ANKRD22在GEO数据集的表达和临床预后分析

  Figure3.Expression and clinical prognostic analysis of ANKRD22 in the GEO datasets

  注：A、B.GES62452和GSE183795数据集中ANKRD22在PC和癌旁的表达；C、D.GES62452和GSE183795数据集中ANKRD22的表达对PC预后的影响；***P＜0.001。

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2.3 ANKRD22蛋白在正常组织和肿瘤组织的表达

从HPA数据库提取正常胰腺组织和胰腺癌组织的免疫组化数据进行比较，结果显示ANKRD22在PC组织中高表达，而在正常胰腺组织中几乎不表达，ANKRD22主要定位于细胞质中（图4）。

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  图4 ANKRD22在胰腺正常组织和PC组织中的免疫组化

  Figure4.Immunohistochemistry of ANKRD22 in normal pancreatic tissue and PC tissue

  注：A.正常胰腺中ANKRD22的免疫组化代表图；B.PC中ANKRD22的免疫组化代表图；标尺：50 μm；放大倍数：×100。

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2.4 敲低ANKRD22能抑制PC的增殖和侵袭能力

使用siNC和siANKRD22转染PANC-1和AsPC-1细胞系72 h后，通过Western blot检测转染效果。两种细胞系中siANKRD22-2和siANKRD22-3敲低效果更好，选择敲低效果最好的siANKRD22-2用于后续功能实验（图5-A）。CCK-8和细胞克隆形成实验表明，敲低ANKRD22后PC细胞的增殖能力显著减弱（图5-B和图 5-C）。Transwell实验表明敲低ANKRD22后细胞侵袭能力明显减弱（图5-D）。

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  图5 敲低ANKRD22对PC细胞增殖和侵袭能力的影响

  Figure5.The impact of ANKRD22 knockdown on the proliferation and invasion capabilities of PC cells

  注：A.Western blot验证ANKRD22的干扰效果；B.CCK-8法检测ANKRD22敲低对细胞增殖能力的影响；C.集落形成实验检测ANKRD22敲低对细胞增殖能力的影响及定量分析；D.Transwell实验检测ANKRD22敲低对细胞侵袭能力的影响（SP×200）及定量分析；*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.5 敲低ANKRD22不影响PC细胞的凋亡

两种PC细胞中分别转染siNC及siANKRD22-2后，使用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果表明敲低ANKRD22并不影响PC细胞的凋亡（图6-A和图6-B）。

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  图6 敲低ANKRD22对PC细胞凋亡的影响

  Figure6.The effect of ANKRD22 knockdown on apoptosis in PC cells

  注：A.流式细胞仪检测ANKRD22敲低对PANC-1细胞凋亡的影响；B.流式细胞仪检测ANKRD22敲低对AsPC-1细胞凋亡的影响；nc.P＞0.05。

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3 讨论

PC相关死亡率近年来呈逐年攀升之势，预计至2030年，PC将跃升为癌症相关死亡的第二大主因[9-10]。对于无法手术切除的PC患者，同步放化疗成为其主要的治疗手段，该方法在一定程度上能够延长患者的OS[11]。近年来，免疫治疗与靶向治疗在肺癌、淋巴瘤、头颈部肿瘤等多种实体瘤中展现出较好的治疗效果，然而在PC治疗领域，其疗效仍显不足，且伴随着患者不良反应的增加[12-13]。鉴于此，探寻有效的治疗靶点，实现对PC细胞的精准杀伤，已成为当前研究亟待攻克的难题之一。

ANKRD22是一种核编码的线粒体蛋白，隶属于锚蛋白重复家族。最新研究揭示，ANKRD22在内质网膜上合成为N-豆蔻酰化的发夹样单位膜蛋白，随后定位于细胞质中的脂滴[14]。脂滴内的蛋白质在细胞的能量代谢、脂质运输、蛋白降解以及隔离转录因子等关键细胞功能中扮演重要角色[15-16]，然而，ANKRD22的具体作用机制尚不明确。研究表明，ANKRD22在正常人类胃上皮细胞中显著表达，而在激活的巨噬细胞中表达水平显著升高。抑制ANKRD22已被证实是一种促进胃黏膜损伤修复的有效靶向治疗策略 [17]。此外，ANKRD22在肿瘤进展过程中可能通过多种机制发挥重要作用。在非小细胞肺癌中，ANKRD22在肿瘤组织中高表达，通过参与E2F转录因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）的转录调节，促进细胞增殖并加速细胞周期进程 [18]。Cao等[19]的研究发现，ANKRD22可通过糖酵解途径促进肺腺癌中巨噬细胞的M2极化，进而形成抑制性肿瘤免疫微环境。在神经胶质瘤中，ANKRD22同样通过上调E2F1介导的MELK表达，促进胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及上皮-间质转化 [20]。在乳腺癌中，ANKRD22调节核仁和纺锤体相关蛋白1的表达，激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及上皮-间质转化[21]。肿瘤免疫微环境诱导的ANKRD22还能促进结肠癌细胞的代谢重编程，靶向ANKRD22可能成为治疗结肠癌的重要策略 [22]。然而，在部分肿瘤中，ANKRD22似乎扮演着抑癌基因的角色。例如，ANKRD22的mRNA水平与前列腺癌分期呈负相关，高表达ANKRD22的患者在根治性前列腺切除术后表现出更长的无病生存期[23]。在卵巢癌中，髓源性抑制细胞是介导肿瘤免疫逃逸的主要免疫抑制细胞，而ANKRD22能够逆转其免疫抑制活性，成为治疗卵巢癌的潜在靶标[24]。

ANKRD22在PC中的表达及其作用尚未见详细报道。有研究基于TCGA公共数据库中PC的临床特征及相关数据，成功构建了包含ANKRD22在内的7个基因组成的预后预测模型 [25]。随后，其他研究进一步扩大了数据样本量，结合TCGA数据集和7个GEO数据集，鉴定出包括ANKRD22在内的9个基因与PC的进展、侵袭性和预后密切相关[26]。本研究发现，ANKRD22在PC组织中显著高表达，且与患者较差的预后显著相关。敲低ANKRD22的表达显著抑制了肿瘤的生长、增殖和侵袭能力，但对PC细胞的凋亡无明显影响。然而，ANKRD22影响PC细胞增殖和侵袭的具体分子机制尚未完全阐明，且本研究未深入探讨ANKRD22的上下游信号通路及其与其他肿瘤相关基因的相互作用，需要进一步的实验探索。综上所述，ANKRD22有望成为PC治疗的新靶点之一，其作用机制及相关靶向通路值得深入研究和探索。

伦理声明：不适用

作者贡献：研究设计：孙志佳、王颖杰；实验操作、数据收集：孙志佳、宋卓、刘旭；统计分析、图表绘制：宋卓、孙志佳、李新技；论文撰写与审定：孙志佳、王颖杰

数据获取：本研究中使用和（或）分析的数据可联系通信作者获取

利益冲突声明：无

致谢：感谢空军军医大学预防医学系流行病学与统计学教研室刘昆教授对文章统计学方法的指导；感谢空军特色医学中心实验室提供实验场地和技术支 持

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