目的  本研究以ATP-柠檬酸裂解酶（ATP citrate lyase，ACLY）为研究重点，以食管癌细胞以及在线数据库为主要研究对象，通过生物信息技术以及细胞生物实验进一步探索ACLY在食管癌细胞中的表达及其对细胞生长、增殖的影响，以期为食管癌临床诊治提供新靶点。

方法  利用TCGA等数据库分析ACLY在食管癌患者中的表达情况，以及ACLY在不同人群食管癌患者及不同临床分期食管癌中的表达情况。同时通过CCK-8法、EdU染色实验、平板克隆实验以及流式细胞仪等细胞基础实验，检测了ACLY变化对食管癌细胞增殖能力和细胞周期的影响。

结果  研究发现ACLY在包括食管癌在内的多种肿瘤组织中高表达。ACLY的表达与人种及性别无关，具有普遍性。ACLY的表达与食管癌的分期及淋巴结转移相关。进一步通过细胞生物学实验，研究证实了敲低ACLY可抑制食管癌细胞的增殖能力且可使细胞周期阻滞，过表达ACLY可提高食管癌细胞的增殖能力且可促进细胞周期进展。

结论  ACLY分子可影响食管癌细胞的增殖能力，ACLY可能是食管癌治疗及预后的潜在靶标。

食管癌作为世界范围内发病率第七和致死率第六的癌症，是威胁人类健康的主要疾病之一，尤其在弱势人群中，食管癌危害性相对更高[1]。全球疾病负担研究（GBD）数据发现，全球因食管癌死亡的人数从1990年的319 332人增至2019年的498 067人，相对增幅达55.97%[2]。根据全球癌症观察2020年线上平台（GLOBOCAN 2020）数据，全球食管癌病例数攀升至60.41万，占所有癌症的3.1%，2020年每18例由于癌症死亡的病例中就有1例与食管癌相关[3]。有数据显示，50%以上的食管癌发病患者位于中国，国内食管癌的组织学亚型中，鳞状细胞癌占比90%以上[4]。因此，深入研究食管癌的发病机制并寻找相关肿瘤标志物显得尤为重要。

ATP-柠檬酸裂解酶（ATP citrate lyase，ACLY）是脂肪酸生物合成中的关键酶，负责将柠檬酸以及辅酶A催化为乙酰辅酶A及草酰乙酸[5]。ACLY主要分布于细胞质基质以及细胞核中[6]，其异常增多与多种恶性肿瘤有关，比如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、宫颈癌、骨肉瘤和肺癌[6-8]，此外，ACLY在肺腺癌以及急性髓系白血病中提示了不良的预后[9-10]。目前，ACLY在食管癌中发挥的作用尚未有研究。本研究利用TCGA、UALCAN等数据库，同时采用生物信息学技术以及CCK8细胞增殖、平板克隆等体外细胞实验，对食管癌组织中ACLY分子的功能进行分析，以期为食管癌的发病机制及预后提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源

在线数据来源于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）、癌症数据在线分析（UALCAN）数据库（http://ualcan.path.uab.edu）、基因表达谱数据动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）。

1.2 细胞系及培养

食管癌细胞系EC109购自中国科学院上海生物科学研究所细胞库（目录号：1101HUM-PUMC 000246）。用含10%胎牛血清（FBS）（Gibco，美国）的RPMI-1640培养基（Servicebio，中国）培养，置于37℃，5% CO₂恒温培养箱中，每2~3 d传代。

1.3 细胞转染

取对数生长期的EC109细胞，常规培养24 h后按照Lipofectamine 2000（Invitrogen，美国）说明书进行转染，分为siNC组、siACLY#1组、siACLY#2组，转染后的细胞用于后续实验。ACLY siRNA两条序列（siACLY#1，GCTCGATTATGCACTGGAA；siACLY#2，GACCA AAGATGGAGTCTAT）及其阴性对照（siNC）由广州锐博生物技术有限公司合成和提供。取对数生长期的EC109细胞，常规培养24 h后按照Lipofectamine 8000（碧云天，中国）说明书进行转染，分为vec组以及oeACLY组，转染后的细胞用于后续实验。pcDNA3.1(+) 以及 pcDNA3.1(+) -ACLY购自武汉淼灵生物科技有限公司。

1.4 实时荧光定量RT-PCR检测mRNA表达

根据Trizol试剂（Invitrogen，美国）说明书提取细胞RNA，按照逆转录试剂盒（TOYOBO，日本）说明书将RNA逆转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR（Roche，瑞士）检测目的基因（GAPDH-R：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG；GAPDH-F：ACCACCCTGTT GCTGT AGCCAA；ACLY-R：AACTTTGCCTCTCTCCGC；ACLY-F：GATGGTCACTCCCTT CTG）表达水平。

1.5 Western印迹检测蛋白表达

预冷的NP40蛋白裂解液（碧云天，中国）冰浴裂解抽提蛋白，于4℃、12 000 r/min条件下离心20 min后取上清，按BCA试剂盒（碧云天，中国）说明书测定蛋白浓度，蛋白变性后取30 μg加入至10%Bis-Tris胶（GE Healthcare，美国）中电泳，电泳结束后将蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h。分别加入抗体ACLY（15421-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司；稀释比1 ∶ 2 000）、p21（25614-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司；稀释比1 ∶ 2 000）、p27（10355-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司；稀释比1 ∶ 2 000），4℃孵育过夜。次日TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP标记的羊抗兔IgG（Servicebio，中国；稀释比1 ∶ 5 000）后室温下孵育2 h，TBST再次洗膜3次后采用ECL化学发光法显影检测目的条带。

1.6 CCK-8法检测细胞的增殖活力

将处理后的EC109细胞接种至96孔细胞培养板中，每孔接种约2 000个细胞，每组设5个复孔。常规培养24、48、72 h后，按照CCK-8试剂盒（Biosharp，中国）说明书加入CCK-8试剂，孵育2 h后在酶联仪（BioTek， 美国）上测450 nm波长处的吸光度值（OD Value）。

1.7 平板克隆实验

取处理后的EC109细胞接种至6孔细胞培养板中，每孔500个。培养10~14 d后，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS清洗后用0.5%结晶紫（Biosharp，中国）染色30 min，清水冲洗后晾干拍照。

1.8 EdU染色实验

处理过的EC109细胞用含EdU染色溶液（RIBOBIO，中国）的培养基换液，在培养箱中孵育2 h后，在4%多聚甲醛中固定并用0.5% TritonX-100透化。然后将细胞在1X Apollo^®染色反应液中孵育，用DAPI溶液再次染色，最后在荧光显微镜（Olympus，日本）下检测。

1.9 流式细胞实验

处理过的EC109细胞用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液处理细胞3~5 min，弃去胰酶，加入2 mL培养基吹打细胞，将细胞悬液转移至经高压灭菌的无酶2 mL EP管中。1 000 rpm离心5 min。离心后丢弃上层培养基，加入1 mL PBS洗涤细胞，1 000 rpm离心5 min，共3次。最后一次洗涤后弃去PBS，加入2 mL 70%乙醇以固定细胞,根据细胞周期检测试剂盒（凯基，中国）说明书进行上机检测，并将数据导入CytExpert软件进一步分析。

1.10 统计学分析

采用GraphPad Prism8.0统计学软件进行分析，P＜0.05为有统计学意义。统计分析之前检验组间变量同质性，所有数据均服从正态分布。两组连续型正态分布的数据比较采用两独立样本t检验，三组及以上连续型正态分布的数据采用单因素方差分析。除另外说明，实验均重复3次。

2 结果

2.1 ACLY在不同肿瘤中的表达

根据GEPIA数据库对33种不同肿瘤类型的分析结果发现，ACLY的mRNA表达水平在结肠腺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形性胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、脑低级别胶质瘤、肝细胞肝癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠腺癌、皮肤黑色素瘤、胃癌以及胸腺癌等14种肿瘤中表达上调（图1）。此外，GEPIA数据库和TCGA数据库分析结果表明ACLY在食管癌中显著高表达（图2）。以上结果提示了ACLY可能是不良的肿瘤相关分子。

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  图1 GEPIA数据库分析ACLY在不同肿瘤组织中的表达

  Figure1.Expression of ACLY in different tumor tissues by GEPIA database

  注：红色为肿瘤组织，绿色为正常组织；X轴：不同肿瘤组织和正常组织样本数量；Y轴：TPM（transcripts per kilobase million）：每千个碱基的转录每百万映射读取的转录本；ACC：肾上腺皮质癌；BLCA：膀胱尿路上皮癌；BRCA：乳腺浸润癌；CESC：宫颈鳞癌和腺癌；CHOL：胆管癌；COAD：结肠腺癌；DLBC：弥漫性大B细胞淋巴瘤；ESCA：食管癌；GBM：多形性胶质母细胞瘤；HNSC：头颈部鳞状细胞癌；KICH：肾嫌色细胞癌；KIRC：肾透明细胞癌；KIRP：肾乳头状细胞癌；LAML：急性髓细胞样白血病；LGG：脑低级别胶质瘤；LIHC：肝细胞肝癌；LUAD：肺腺癌；LUSC：肺鳞癌；MESO：间皮瘤；OV：卵巢浆液性囊腺癌；PAAD：胰腺癌；PCPG：嗜铬细胞瘤；PRAD：前列腺癌；READ：直肠腺癌；SARC：肉瘤；SKCM：皮肤黑色素瘤；STAD：胃癌；TGCT：睾丸癌；THCA：甲状腺癌；THYM：胸腺癌；UCEC：子宫内膜癌；UCS：子宫肉瘤；UVM：葡萄膜黑色素瘤

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  图2 ACLY在食管癌中的表达

  Figure2.ACLY expression in esophageal cancer

  注：A：GEPIA数据库分析ACLY在食管癌中的表达，图中红色为肿瘤组织，黑色为正常组织对照；B：TCGA数据库分析ACLY在食管癌中的表达，图中红色为肿瘤组织，蓝色为正常组织对照；***P＜0.001；X轴：肿瘤组织和正常对照组织样本数量，Y轴：TPM（transcripts per kilobase million）：每千个碱基的转录每百万映射读取的转录本

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2.2 ACLY在不同人种食管癌患者中的表达

UALCAN数据库分析表明，ACLY在不同种族、性别食管癌患者肿瘤组织中的表达无显著差异（图3），提示ACLY在食管癌患者中的分布具有普遍性。

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  图3 ACLY在不同人群中的表达

  Figure3.ACLY expression in different groups

  注：A：ACLY在不同种族人群中的表达；B：ACLY在不同性别人群中的表达；ns表示组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）

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2.3 ACLY表达与食管癌患者临床病理特征的关系

UALCAN数据库分析表明，ACLY在食管肿瘤鳞状细胞癌和腺癌组织中的表达差异无统计学意义（图4-A）。食管癌肿瘤分期I期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期肿瘤组织中ACLY表达量与正常组织相比高表达（图4-B），肿瘤组织淋巴结转移状态N0、 N1、N2和N3中ACLY表达量与正常组织相比高表达（图4-C），提示ACLY的异常表达与食管癌的临床表征有关。

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  图4 ACLY表达与食管癌患者临床分型的关系

  Figure4.Relationship between ACLY expression and clinical classification of patients with esophageal cancer

  注：A：ACLY表达与肿瘤组织学的关系；B：ALCY表达与肿瘤分期的关系；C：ACLY表达与淋巴结转移的关系；**P＜0.01，***P＜0.001，ns表示组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）

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2.4 敲低以及过表达ACLY后对食管癌细胞增殖能力的影响

实时荧光定量RT-PCR（图5-A、6-A）与Western印迹（图5-B、6-B）检测结果表明，与siNC组相比，siACLY#1组、siACLY#2组ACLY的表达水平均显著下调；与vec组相比，oeACLY组ACLY的表达水平显著上调。CCK-8实验结果显示，在EC109细胞中siACLY#1组、siACLY#2组细胞的OD值均低于siNC组，说明敲低ACLY后，EC109细胞的活力明显下降（图5-C）；在EC109细胞中oeACLY组细胞的OD值高于vec组，说明过表达ACLY之后，EC109细胞的活力明显上升（图6-C），差异均具有统计学意义。平板克隆实验提示，siACLY#1组、siACLY#2组的细胞克隆数明显少于siNC组，说明敲低ACLY抑制了食管癌的增殖能力（图5-D），而oeACLY组细胞克隆数明显高于vec组，说明过表达ACLY促进了食管癌的增殖能力（图6-D），差异均具有统计学意义。EdU染色实验显示，siACLY#1组、siACLY#2组中处于增殖分裂期的细胞占所有细胞的比例明显低于siNC组（图5-E），而oeACLY组中处于增殖分裂期的细胞占所有细胞的比例明显高于vec组（图6-E）。以上结果均提示ACLY可影响食管癌细胞的增殖，具体体现为敲低ACLY可抑制食管癌细胞的增殖，过表达ACLY可促进食管癌细胞的增殖。

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  图5 ACLY敲低后对EC109细胞增殖能力的影响

  Figure5.Effect of ACLY knockdown on the proliferative capacity of EC109 cells

  注：A：实时荧光定量RT-PCR检测转染效果；B：Western印迹检测转染效果；C：CCK8实验检测敲低ACLY后细胞活力变化；D：平板克隆实验检测敲低ACLY后细胞增殖速度；E：EdU染色实验检测敲低ACLY后细胞增殖变化；**P＜0.01，***P＜0.001

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  图6 过表达ACLY对EC109细胞增殖能力的影响

  Figure6.Effect of overexpression of ACLY on the proliferative capacity of EC109 cells

  注：A：实时荧光定量RT-PCR检测转染效果；B：Western印迹检测转染效果；C：CCK8实验检测过表达ACLY后细胞活力变化；D：平板克隆实验检测过表达ACLY后细胞增殖速度；E：EdU染色实验检测过表达ACLY后细胞增殖变化；**P＜0.01，***P＜0.001

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2.5 敲低以及过表达ACLY后对食管癌细胞周期的影响

细胞周期检测结果表明，与siNC组相比，siACLY#1组、siACLY#2组G1期细胞增加，而G2和S期细胞减少（图7-A、图7-B）；与vec组相比，oeACLY组G1期细胞减少，而G2和S期细胞增加（图8-A、图8-B），差异均具有统计学意义。Western印迹结果表明，siACLY#1组、siACLY#2组中周期调节蛋白p21、p27蛋白的表达水平均显著高于siNC组（图7-C），而oeACLY组中周期调节蛋白p21、p27蛋白的表达水平均显著低于vec组（图8-C）。以上结果表明ACLY可影响细胞周期，具体表现为敲低ACLY后食管癌细胞发生周期阻滞，过表达ACLY后细胞周期得到促进。

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  图7 ACLY敲低后对EC109细胞周期的影响

  Figure7.Effect of ACLY knockdown on the cell cycle of EC109 cells

  注：A、B：流式细胞技术检测敲低ACLY后细胞周期变化；C：Western印迹检测敲低ACLY后细胞周期相关蛋白的变化；***P＜0.001

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  图8 过表达ACLY对EC109细胞周期的影响

  Figure8.Effect of ACLY overexpression on the cell cycle of EC109 cells

  注：A、B：流式细胞技术检测过表达ACLY后细胞周期变化；C：Western印迹检测过表达ACLY后细胞周期相关蛋白的变化；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

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3 讨论

ACLY作为一种关键代谢酶，在肿瘤细胞中发挥中枢作用，还可通过脂肪酸的从头合成路径以支持膜的生物合成，对肿瘤细胞的生长和增殖非常重要。PI3K-Akt途径的激活可以通过磷酸化ACLY以刺激其生物活性[11]，此外，ACLY还可以在多种位点被其他激酶磷酸化，例如核苷二磷酸激酶[12]和环腺苷酸依赖性蛋白激酶[13]。如前所述，ACLY在多数肿瘤中表达上升，在临床中，ACLY在人卵巢癌中同样高表达，可以作为预后因素。ACLY敲低可抑制细胞增殖，并在体外诱导细胞周期停滞，提示ACLY可作为卵巢癌的新型治疗靶点[14]；抑制ACLY同样可导致肺癌细胞的生长停滞[9]，此观点在临床患者标本中得到了证实[15]，在本研究中也得到了一致的结果。有趣的是，补充胰岛素可以挽救上述的增殖停滞；相反，脂肪酸棕榈酸酯可进一步诱导细胞死亡，表明ACLY的作用机制极可能与营养代谢有关[16]，这为本研究探究ACLY在食管癌中发挥作用的潜在分子机制提供了方向。在与ACLY相关的抗肿瘤治疗方面，用特定药物抑制ACLY不仅可以抑制对葡萄糖依赖性生长的肿瘤细胞，还可以通过诱导细胞分化来抑制癌症进展[17]。ACLY抑制剂可阻碍甲状腺癌细胞的三维生长和细胞侵袭，此外，ACLY抑制剂协同使用可以增强索拉非尼的细胞毒性[18]。在结直肠癌中，ACLY通过诱导肿瘤干细胞休眠从而造成肿瘤的耐药性甚至复发[19]；同样地，ACLY也是前列腺癌特异性治疗的可能靶点[20]。以上说明了ACLY的临床意义，ACLY分子在抗肿瘤治疗中的潜力，提示其可作为食管癌治疗的靶点。

本研究利用TCGA等数据库分析表明了ACLY在结肠腺癌、肾细胞癌以及肺癌等肿瘤组织中的异常表达，这一结果与以往的研究一致。此外，数据库分析还发现了ACLY在食管癌组织中也呈高表达状态，并且ACLY在不同人群食管癌患者肿瘤组织中的表达无显著差异，提示ACLY在食管癌患者中的分布具有普遍性。本研究进一步利用细胞生物学实验证实，敲低ACLY可抑制细胞的增殖能力且使细胞周期阻滞。

本研究通过生物信息学技术以及细胞生物学实验，重点对食管癌中ACLY基因进行分析，揭示了ACLY在食管癌中发挥的促癌作用。ACLY表达与食管癌细胞侵袭转移之间的关系可做进一步的研究。本研究不足之处在于并未更深一步探究ACLY与食管癌发生与发展之间的分子机制，以及没有开展体内动物实验进行验证。综上所述，ACLY基因表现出了其在肿瘤发生发展方面的潜在作用，预示其可能是食管癌治疗与预后的潜在靶标。

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