目的  探究去铁胺喷剂（deferoxamine，DFO）对Ⅲ度烧伤慢性创面愈合的影响及其作用机制。

方 法  通过细胞毒性检测筛选出可用于后续实验的DFO喷剂浓度。通过成管实验检测DFO喷剂对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）生成血管能力的影响。通过FerroOrange探针、活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测以及丙二醛测定，评估DFO喷剂对细胞内亚铁离子（Fe²⁺）积累、细胞内ROS生成及脂质氧化反应的影响。将SD雄性大鼠随机分为对照组和DFO喷剂治疗组（DFO组），使用台式超温控烫伤机制备大鼠Ⅲ度烧伤慢性创面模型，并通过定时观察记录创面愈合情况。采用苏木精-伊红和马松染色评估组织学变化。免疫组化染色观察血小板内皮细胞黏附分子1（CD31）、铁蛋白（Ferritin）和长链酰基辅酶A合成酶4（long-chain acyl-CoA synthase 4，ACSL4）蛋白表达水平。

结果  浓度5 μg/mL的DFO喷剂能够显著促进HUVEC细胞生成血管，并且显著抑制细胞内Fe²⁺积蓄（P＜0.001），降低细胞内ROS生成（P＜0.01），减少细胞内脂质氧化反应（P ＜0.001）。使用DFO喷剂治疗的Ⅲ度烧伤大鼠慢性创面，能够更快恢复皮肤完整结构（P ＜0.05），沉积更多胶原蛋白（P ＜0.001）。与对照组相比，DFO喷剂组的大鼠创面组织中CD31表达水平显著升高（P ＜0.001），Ferritin表达水平显著下降（P＜0.001），ACSL4表达水平显著下降（P＜0.001）。

结论  DFO喷剂明显促进SD大鼠Ⅲ度烧伤慢性创面愈合，其作用机制可能为促进血管再生，阻止细胞内Fe²⁺积蓄，降低ROS水平，减少脂质过氧化反应，抑制铁死亡通路表达从而促进创面愈合。

烧伤是一种可导致组织功能障碍的皮肤损伤，严重的皮肤烧伤会给伤患带来严重的生理痛苦，甚至危及伤患生命[1]。在全球范围内，每年有超过300 000人死于热烧伤或其他类型的烧伤，构成严重的公共卫生问题[2-3]。其中Ⅲ度烧伤，也称为全层烧伤，渗透到皮肤组织的所有层，由于创面不规则、广泛渗出、感染等因素导致氧化应激反应和长期炎症反应，形成难愈合的慢性创面，常常需要手术切除和表面置换[4-6]。

铁在人体内微量存在，但在氧运输、电子转移、能量代谢和DNA合成等多种重要功能中发挥作用[7-9]。然而过多的铁会导致不完全配体的Fe²⁺，这些积蓄的Fe²⁺会与过氧化物形成活性氧（reactive oxygen species，ROS）。如果这些自由基接触重要的脂质膜、蛋白质或核酸，就会造成重大损害[10-12]。去铁胺（deferoxamine，DFO）于1968年被美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用作铁螯合剂。目前，铁螯合剂已被证实可用于治疗各种铁过载疾病和氧化应激介导的疾病，包括肝铁超负荷疾病、糖尿病、炎症和动脉粥样硬化等[13-15]。本研究旨在探讨DFO喷剂能否通过减少伤口周围细胞内Fe²⁺含量、减少ROS的产生、改善组织血管生成和改善胶原蛋白沉积来促进Ⅲ度烧伤慢性创面愈合。

1 材料与方法

1.1 细胞和动物及主要试剂与仪器来源

细胞与动物：人皮肤成纤维细胞（HSF）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）购自湖南丰晖生物科技有限公司；10只Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重250~300 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司。

主要试剂：DMEM高糖培养基、1640培养基、胎牛血清（FBS）、CCK-8检测试剂盒购自北京兰杰柯科技有限公司；去铁胺（DFO，Y0001934）购自美国Sigma公司；Erastin诱导剂和FerroOrange检测探针购自日本同仁化学研究所；ROS检测试剂盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）脂质过氧化检测试剂盒购自北京碧云天生物技术有限公司；抗CD31单克隆抗体、ACSL4多克隆抗体购自美国Proteintech Group公司。

主要仪器：YLS-5Q台式超温控烫伤机（正华，中国）、通用型小动物麻醉机（瑞沃德，中国）、倒置荧光显微镜（Olympus，日本）、流式细胞仪（BD，美国）、多功能酶标仪（PerkinElmer，美国）。

1.2 细胞毒性检测

使用CCK-8试剂盒检测不同浓度的DFO对HSF细胞活力的影响。将HSF细胞以每孔8 000个细胞的密度接种到96孔板中（5个复孔）。贴壁24 h后，用不同浓度的DFO溶液（5 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100  μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL）处理细胞24 h。去除培养基后，向每个孔中加入100 μL 10%的CCK-8溶液，37 ℃避光孵育1 h。使用多功能酶标仪测量450 nm处的吸光度，使用ImageJ软件进行定量分析。

1.3 成管实验

采用成管实验评价DFO对HUVEC细胞生成血管的潜能。取50 μL的基质胶（Matrigel）溶液加入96孔板，37 ℃凝胶孵育1 h，然后将HUVEC细胞以每孔1×10⁴个细胞的密度接种到Matrigel上，对照组和实验组分别加入50 μL的PBS和DFO溶液，孵育6 h后，倒置显微镜下观察毛细血管样结构的形成，使用ImageJ软件的血管生成分析对管网进行定量分析，包括总长度和分支数。

1.4 胞内铁染色

胞内亚铁水平（Fe²⁺）的测定使用FerroOrange检测探针试剂盒。收集不同试剂处理的HSF细胞，分为普通培养基（阴性对照组）、Erastin铁死亡诱导剂（阳性对照组）和Erastin+DFO（DFO组）；随后PBS洗涤并在铁测定缓冲液中匀浆；然后将5 μL铁还原剂加入标准孔中，向每个样品中加入5 μL检测缓冲液，混合并孵育30 min。最后加入100 μL探针，混合并孵育1 h后，立即在倒置荧光显微镜下拍照，使用ImageJ软件进行定量分析。

1.5 ROS和MDA含量检测

使用ROS检测试剂盒评估细胞内ROS生成。按照1 ∶ 1 000的比例，用PBS稀释DCFH-DA，去除不同试剂处理的HSF细胞培养基，分为普通培养基（阴性对照组）、Rosup（阳性对照组）和Rosup+DFO（DFO组）；加入稀释好的探针，在37  ℃细胞培养箱中孵育20 min，使用PBS洗涤3次，使用酶标仪分别在480 nm和530 nm测定吸光度。

使用MDA测定试剂盒评估细胞裂解物中相对MDA浓度。收集不同试剂处理的HSF细胞（同ROS检测）；使用细胞裂解液进行裂解，离心后取上清液备用；根据配比添加PBS、标准品、待测样品和MDA检测工作液，混匀，100 ℃加热15 min；水浴冷却至室温，离心后取上清液，使用酶标仪在532 nm测定吸光度，根据标准曲线计算MDA的摩尔浓度。

1.6 大鼠Ⅲ度烧伤创面模型制备

实验方案由湖北省预防医学科学院湖北省疾病预防控制中心实验动物管理与使用委员会审查和批准（批号：202320225）。Ⅲ度烧伤创面大鼠模型是依据其他文献中所报道的方法建立 [16- 18]。将SD雄性大鼠用异氟醚麻醉，使用弧形金属冲头2 cm²将台式超温控烫伤机加热至80  ℃，以10 kPa紧压在大鼠背部剃光的皮肤上18 s，造成Ⅲ度烧伤，每只大鼠背部制备4个烧伤创面。24 h后，用剪刀手术去除死皮。将大鼠随机分为2组，每组5只：①空白对照组（阴性对照组）；②DFO组（DFO喷剂治疗组），5 μg/mL DFO喷洒于创面，每天一次。然后将Tegaderm™薄膜（3M，美国）覆盖在伤口区域，每3 d更换一次。

1.7 创面闭合率分析

观察各组的生存和创面愈合情况。根据手术后获得的照片确定每个烧伤创面大小的变化，并通过ImageJ进行定量分析。使用公式计算伤口闭合率以表示创面大小相对于原始大小的变 化:

其中S₀代表第0 d的原始伤口面积，S_A代表第A d的伤口面积。

1.8 组织学和免疫组化评估

治疗的第9、30 d，每次每组处死2只大鼠并收集伤口标本。然后，进行苏木精-伊红（HE）染色，评估伤口的表皮再生和肉芽组织形成。Masson染色用于评估伤口床中的胶原沉积。另一方面，分别使用抗CD31、Ferritin、ACSL4抗体进行免疫荧光染色评估组织炎症反应、血管形成、铁含量及铁死亡相关指标。

1.9 统计学分析

使用统计软件 SPSS 17.0 和GraphPad Prism 9 对所有实验数据进行统计分析，结果以均数和标准差（）表示。组间差异通过单因素方差分析和t 检验分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DFO对HSF细胞生长的影响

不同浓度的DFO与HSF细胞共培养1、3和5 d后，仅5 μg/mL浓度的DFO对HSF细胞的生长无明显抑制作用，因此后续均采用5 μg/mL浓度的DFO进行实验（图1）。

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  图1 不同浓度DFO对HSF细胞的细胞毒性检测

  Figure1.Cytotoxicity test of different concentrations of DFO on HSF cells

  注：A.HSF细胞在不同浓度DFO孵育1 d后的细胞存活率；B.HSF细胞在不同浓度DFO孵育3 d后的细胞存活率；C.HSF细胞在不同浓度DFO孵育5  d后的细胞存活率；*P＜0.05，***P＜0.001，ns表示无统计学意义（P＞0.05）。

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2.2 DFO促进HUVEC细胞生成血管

使用DFO对HUVEC细胞进行处理后，相同时间内血管形成的数量和质量有明显的增加。与对照组相比，DFO组的血管形成总长度为对照组的235.54%（P＜0.01），血管形成的分支数量为对照组的188.39%（P＜0.05），说明DFO有显著促进HUVEC细胞生成血管的作用（图2）。

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  图2 DFO对HUVEC细胞生成血管的影响及定量分析

  Figure2.The effect of DFO on the angiogenesis of HUVEC cells and quantitative analysis

  注：A.对照组和DFO组HUVEC细胞生成血管的代表性图像；B和C.血管形成的总长度和分支数的定量分析；*P＜0.05，**P＜0.01；标尺：500  μm。

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2.3 DFO能够抑制细胞内Fe2+积蓄，减少ROS的生成

使用Erastin铁死亡诱导剂作为阳性对照组，DFO能够显著降低HSF细胞内Fe²⁺的积蓄（P ＜0.001），降至与阴性对照组水平相当（P ＞0.05）（图3-A、3-B）。使用Rosup作为阳性对照组，探究DFO对ROS和MDA水平的影响。DFO能够显著降低ROS生成（P＜0.01），减少细胞内MDA水平（P＜0.001），与阴性对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）（图3-C、3-D）。

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  图3 DFO对HSF细胞铁死亡指标的影响及定量分析

  Figure3.The effect of DFO on the ferroptosis indicators of HSF cells and quantitative analysis

  注：A.不同组HSF细胞暴露24 h后细胞内Fe2+积蓄的荧光代表性图像；B.HSF细胞内Fe2+积蓄的定量分析；C.不同组HSF细胞ROS生成的定量分析；D.不同组HSF细胞内MDA含量的定量分析；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，ns表示无统计学意义（P＞0.05）；标尺：500 μm。

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2.4 DFO促进大鼠Ⅲ度烧伤创面愈合

伤后9、20和30 d，DFO组大鼠创面愈合率显著高于对照组（P＜0.05）（图4-A、4-B）。伤后30 d对创面组织进行病理学观察，HE染色显示，对照组的大鼠创面组织没有形成完整连续的表皮，并且存在大量炎症细胞浸润，胶原纤维结构松散并存在较大裂隙，缺少皮肤附属器；而DFO组存在连续的表皮，胶原纤维粗大且结构致密，有皮肤附属器生成，皮肤结构基本正常（图 4-C）。定量分析显示对照组和DFO组创面组织胶原沉积差异有统计学意义（P＜0.001）（图 4-D）。

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  图4 对照组和DFO组大鼠Ⅲ度烧伤创面愈合情况

  Figure4.The healing condition of third-degree burn wounds in the control group and the DFO group of rats

  注：A. Ⅲ度烧伤后大鼠各时间点创面情况的代表性图像（标尺：1 cm）；B. Ⅲ度烧伤后大鼠各时间点创面再上皮化面积定量分析（n=4）；C. Ⅲ度烧伤后大鼠第9天创面组织HE和Masson染色的代表性图像（绿色箭头为表皮，红色箭头为炎症细胞，蓝色箭头为胶原蛋白，黄色箭头为皮肤附属器；标尺：400 μm和100 μm）；D. Ⅲ度烧伤后大鼠第9天创面胶原沉积定量分析（n=5）；*P＜0.05，***P＜0.001。

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2.5 创面组织标志物的表达

伤后第9天，DFO组大鼠创面组织中CD31阳性面积百分比明显高于对照组（P ＜0.001），表明DFO喷剂治疗在大鼠创面愈合过程中能够促进血管的生成（图5-A、5-B）。此外，DFO组的大鼠创面组织中Ferritin阳性面积百分比明显低于对照组（P＜0.001），表明相比对照组，DFO组参与愈合的细胞中Fe²⁺没有过度积蓄的现象（图 5-C、5-D）。同时，使用ACSL4标志物反映创面组织中细胞参与铁死亡信号通路表达的数量。对照组的大鼠创面组织中ACSL4阳性面积百分比明显高于DFO组（P＜0.001），表明对照组的大鼠创面中，有更多的细胞参与细胞铁死亡信号通路，不利于创面愈合（图5-E、5-F）。

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  图5 对照组和DFO组大鼠Ⅲ度烧伤后第9天的创面组织标志物的表达及定量分析

  Figure5.Expression and quantitative analysis of wound tissue markers in the control group and the DFO group of rats on the 9th day after third-degree burns

  注：A.Ⅲ度烧伤后第9天大鼠创面CD31染色代表性图像；B.CD31染色的定量分析；C.Ⅲ度烧伤后第9天大鼠创面Ferritin染色代表性图像；D.Ferritin染色的定量分析；E.Ⅲ度烧伤后第9天大鼠创面ACSL4染色代表性图像；F.ACSL4染色的定量分析；***P＜0.001；标尺：100 μm。

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3 讨论

皮肤烧伤是一种动态损伤，越来越多的研究表明，烧伤创面微环境通常存在ROS水平升高、炎症持续存在、细胞死亡增加的问题[19]。并且ROS积累会导致促炎细胞因子的分泌增加，使修复过程变得更加漫长[20]。本研究结果表明，DFO能够有效阻止Fe²⁺在胞内积蓄，降低ROS和MDA水平，并促进HUVEC细胞生成血管，有利于Ⅲ度烧伤创面的慢性愈合。

有研究表明DFO可以改善各种类型伤口的愈合情况，包括糖尿病创面、压疮创面和辐照创面 [21-24]。研究显示DFO促进糖尿病创面愈合主要是通过其铁清除特性减少Fe²⁺介导的ROS生成，降低氧化应激和炎症，以及稳定缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α），改善组织血管形成这两个主要机制介导[25-26]。研究还显示DFO可以改善胶原蛋白沉积和原纤维组织 [27]。因此，本研究使用SD大鼠模拟Ⅲ度烧伤创面，并通过免疫组织化学染色检测创面组织中各种标志物的表达情况。HE和Masson染色结果显示，使用DFO喷剂治疗的创面，表皮再上皮化的速度显著增加，炎性细胞浸润减少，胶原蛋白沉积升高，并且提前开始构建皮肤附属器。免疫荧光CD31标志物的结果显示使用DFO喷剂治疗的创面血管再生增加。与体外实验结果一致，提示DFO喷剂可以缩短Ⅲ度烧伤创面皮肤组织炎症持续时间，促进创面愈合。

细胞内铁积累和脂质过氧化是导致铁死亡的两个主要生化事件，Fe²⁺具有不稳定性和高反应活性，通过芬顿反应产生羟自由基，可直接与细胞膜、质膜中的多不饱和脂肪酸反应，产生大量脂质ROS，导致细胞铁死亡[28-30]。目前关于DFO促进Ⅲ度烧伤创面愈合的机制尚不完全清楚，基于此，本研究针对DFO本身铁螯合剂的作用，推测DFO能够通过减少细胞内Fe²⁺积蓄，降低细胞铁死亡数量从而加速创面细胞的增殖和迁移。在伤后第9天对创面组织进行免疫荧光染色，使用DFO喷剂治疗后的创面组织显示出更低的铁蛋白表达水平，并且铁死亡信号通路关键蛋白ACSL4的表达水平也降低，提示DFO喷剂在Ⅲ度烧伤创面中能够抑制铁死亡从而加速创面愈合。

本研究存在一定局限性。首先，由于DFO在人体血浆中的半衰期仅为20 min[31]，单纯使用DFO喷剂可能因其较短的半衰期而限制其对Ⅲ度烧伤创面愈合的作用持续时间。其次，在愈合过程中可能会形成痂皮，这会阻碍DFO喷剂直接作用于创面表面。因此，未来的研究应考虑采用可持续释放DFO的给药形式，例如水凝胶等，以维持湿润环境，从而抑制组织干燥和痂皮形成，最大限度地延长DFO的作用时间。

综上所述，本研究结果表明，DFO喷剂可以促进Ⅲ度烧伤大鼠创面血管再生和组织修复，可能与铁死亡通路有关。DFO喷剂可能通过减少创面细胞胞内Fe²⁺积蓄，降低ROS水平和脂质过氧化反应，减少参与铁死亡细胞数量而促进创面修复。本研究为阐释局部应用DFO促进Ⅲ度烧伤创面愈合及深入探讨其病理机制提供了科学依据，为揭示DFO在Ⅲ度烧伤创面愈合中的作用机制提供了新思路。

伦理声明：本研究已获得湖北省预防医学科学院湖北省疾病预防控制中心实验动物管理与使用委员会审核批准（批号：202320225）

作者贡献：研究设计、实验操作和论文撰写：柴朗捷；数据采集和分析：柴朗捷、李琴；论文审定：黄姜龙、郭亮

数据获取：不适用

利益冲突声明：无

致谢：不适用

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