肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）发病率在全球范围内呈上升趋势，主要与人口老龄化、高血压、肥胖和环境暴露等因素有关[1]。其中透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是RCC最常见的一种亚型，约占所有RCC病例的75%~80%[2]。近年来，随着影像学技术的发展，越来越多的早期ccRCC被发现[3]，但其临床治疗面临着巨大的挑战，尤其在晚期和转移性病例中，传统放化疗对ccRCC的疗效有限[4]。作为一门新兴技术，消融技术为肿瘤治疗提供了新的选择和治疗方案[5]，但该技术因肾肿瘤体积大、肾解剖位置深、脂肪覆盖多以及传统检测手段CT、核磁共振等难以在术中良好定位和显影等原因[6]，并未在肾癌治疗中得到广泛应用。而近红外荧光成像技术在实时指导肿瘤手术完整、安全切除等方面表现出巨大潜力，但因其靶向特异性不强、示踪剂易清除、示踪剂毒性不易控制等原因，也未能在临床诊疗中广泛应用[7]，因此，寻找新的靶向肿瘤显影方法及肿瘤治疗方案成为研究重点。
MN/CA9是碳酸酐酶家族成员，是细胞表面糖蛋白和肿瘤相关抗原[8]，在ccRCC、尿路上皮癌和三阴性乳腺癌等多种实体瘤中表达[9]，其在ccRCC中表达率高达95%[10]，与肿瘤生长、侵袭和患者预后密切相关[11]。其特异性成为ccRCC诊断和预后的重要生物标志物，同时也为该疾病的靶向治疗提供了潜在的靶点[12]。基于此，研究团队设计了新型纳米材料MN受体靶向抑制系统（MN receptor targeted inhibition system，MTIS），能够特异靶向并定位肿瘤，使肿瘤显影，并具有抑制肿瘤生长的功能，为复杂的ccRCC诊疗提供了新的工具和方法，有望推动更精准的诊断和治疗策略的发展。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要试剂与材料
1640细胞培养基（美国Gibco公司），5A细胞培养基（美国Gibco公司），Matrigel基质胶（美国康宁公司），无菌PBS缓冲液（大连美仑生物技术有限公司），胎牛血清（美国赛默飞世尔科技公司），多聚甲醛（中国白鲨生物科技有限公司），DAPI染色液（北京索莱宝科技有限公司），MN抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），0.2%结晶紫溶液（北京索莱宝科技有限公司），胰蛋白酶（中国碧云天生物技术股份有限公司），CCK-8细胞增殖检测试剂盒（中国碧云天生物技术股份有限公司）。
1.1.2 细胞来源及培养
786-O（ccRCC细胞系）、Caki-1（ccRCC细胞系）、Renca（小鼠肾癌细胞系）均购置于上海富衡生物科技有限公司。786-O、Renca细胞培养于含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素/链霉素的1640培养基中，Caki-1细胞在含有 10%胎牛血清的5A细胞培养基中培养。所有细胞置于37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。
1.1.3 实验仪器
酶联免疫吸附检测仪（美国SpectraMax公司），CO2细胞培养箱（中国博科控股集团有限公司），激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，CLSM）（德国蔡司公司），高速离心机（美国赛默飞世尔科技公司），光学显微镜（日本奥林巴斯公司），IVIS成像系统（美国Spectrum公司），4 ℃冰箱（中国海尔公司）。
1.1.4 实验动物
雌性小鼠9只（辽宁长生生物技术股份有限公司），6周龄，独立通风笼中饲养，定制饲料喂养，每3 d更换食物、水、垫料。本研究已通过哈尔滨医科大学附属第四医院伦理委员会审核批准（批号：2024- DWSYLLCZ-30）。
1.2 实验方法
1.2.1 TCGA数据库肾癌基因数据分析
通过癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库对ccRCC（KIRC/ccRCC）患者的基因表达数据进行差异分析，包括ccRCC样本和癌旁正常组织样本共604例，使用DESeq2筛选前20个差异表达显著的基因，基因筛选标准为P值≤0.05，通过R语言“ggplot2”包生成热图。使用泛肾癌队列（KICH+KIRC+KIRP）进行癌和癌旁基因差异表达分析，包括887个RCC和129个癌旁正常样本的表达谱数据。
1.2.2 纳米探针的构建
MTIS纳米探针购置于杭州丹港生物科技有限公司，通过固相法合成（SCYNTNHVPLSPKY-Cy）。
1.2.3 CLSM验证纳米材料与肿瘤细胞共定位
按照以下步骤评估MTIS的靶向能力：首先，将5×104个细胞均匀铺展在CLSM专用培养皿中，并置于细胞培养箱中孵育24 h。随后，向培养皿中加入MTIS，并在37 ℃恒温孵箱中孵育15 min。孵育结束后，使用PBS对培养皿进行3次洗涤，以去除未结合的MTIS。使用多聚甲醛对细胞进行20 min的固定处理。固定完成后，向培养皿中加入MN抗体，并将其置于4 ℃的冰箱中过夜孵育。24 h后取出培养皿，并加入荧光二抗，在37 ℃下孵育1 h。荧光二抗能与MN抗体结合并发出荧光信号，可在显微镜下可视化观察MN抗体与细胞内目标分子或结构的结合情况。
1.2.4 CCK-8实验检测细胞毒性
通过以下步骤评估MTIS在Caki-1细胞系中的细胞毒性：首先，将Caki-1细胞以每孔5 000个细胞的密度精确接种在96孔板中。随后，将细胞置于细胞培养箱孵育24 h，使其达到合适的生长状态和密度。将MTIS溶液加入含有细胞的孔中，使细胞暴露于MTIS中15 min后，更换培养基并继续培养72 h，在24 h、48 h、72 h等时间点测吸光度，以观察MTIS对细胞长期生长的影响。而对照组则使细胞暴露于PBS中15 min，其他处理方式与MTIS组相同。测定吸光度之前，向每个孔中加入CCK-8试剂，孵化2 h后，使用微孔板读数器在450 nm波长处测量每个孔的OD值，并根据公式计算细胞存活率。
1.2.5 Transwell实验检测肿瘤细胞迁移和侵袭
采用配备有8 μm孔径聚碳酸酯膜的24孔Transwell小室系统，对细胞的迁移与侵袭能力进行体外评估。Transwell小室上室被预先均匀涂覆了一层Matrigel基质胶，以模拟细胞在体内的侵袭过程。在上室中接种1×105个细胞，并在添加了PBS、MTIS（浓度为2×10-5 M）的含10%胎牛血清培养基中培养24 h。培养结束后，使用4%多聚甲醛溶液对细胞进行固定处理，以确保细胞形态的稳定；使用0.2%结晶紫溶液对细胞进行染色。在光学显微镜下，对迁移到Transwell小室下表面的细胞进行检查与计数，评估不同处理条件下细胞的迁移与侵袭能力。
1.2.6 小鼠皮下种瘤模型的构建
使用无菌注射器吸取含有5×106个细胞的悬液并注射至小鼠胁部皮肤下约2~5 mm的深度，待肿瘤体积增长至约50 mm3时，随机选取其中3只小鼠用于成像实验，通过尾静脉注射方式向小鼠体内注入荧光探针，以追踪纳米探针在体内的分布与代谢情况。在注射后的1 h、7 h、12 h、24 h四个时间点，使用IVIS活体成像系统对小鼠进行荧光成像分析，以观察纳米探针在肿瘤部位的积聚情况。为了评估MTIS的抗肿瘤效果，将其余6只小鼠随机分为MTIS、PBS两组，每组3只，每2 d向小鼠体内注射1次纳米探针，共计处理5次。在首次注射后的第28天，对小鼠实施安乐死，并仔细测量肿瘤体积，以此作为评估MTIS抗肿瘤作用的指标。
1.3 统计学分析
使用GraphPad Prism 8.3.1软件进行统计学分析。数据以均数和标准差（
）表示，采用t检验和单因素方差分析进行组间差异比较。所有实验均重复3次及以上，每个实验的样本量至少为3个样本（n≥3）。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 TCGA数据库肾癌基因差异表达分析
如图1所示，MN、NDUFA4L2、ANGPTL4、FABP7、NPTX2、CD70、SLC6A3等多个基因表达水平在ccRCC组织中显著升高，其中，MN受体变化尤为突出，其logFC值高达7.370 861，远高于其他基因如NDUFA4L2（logFC：6.550 539）、ANGPTL4（logFC：5.551 477）、FABP7（logFC：5.508 645）和NPTX2（logFC：5.271 748）。
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图1 ccRCC与正常组织基因差异表达分析
Figure1.Analysis of gene differential expression in ccRCC and normal tissues
利用TCGA数据库对ccRCC及其癌旁组织进一步分析发现，MN受体在肿瘤组织中显著高表达，而在正常组织中几乎不表达（图2）。鉴于此，本研究以MN受体为研究靶点，探讨MN受体的功能、调控机制及其在ccRCC发生和发展中的作用。
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图2 MN在肿瘤组织中高表达
Figure2.High expression of MN in tumor tissues
注：****P<0.000 1。
2.2 MTIS细胞水平靶向效果检测
在ccRCC细胞系786-O和Caki-1中，红色荧光标记的MTIS与绿色荧光标记的MN受体高度重合，呈现出显著的共定位现象，验证了MN靶向基序所具备的精准且有效的靶向能力（图3、图4）。
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图3 786-O细胞系中MTIS靶向肿瘤细胞情况
Figure3.MTIS targeting tumor cells in 786-O cell line
注：标尺：50 μm，放大倍数：×20。
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图4 Caki-1细胞系中MTIS靶向肿瘤细胞情况
Figure4.MTIS targeting tumor cells in Caki-1 cell line
注：标尺：50 μm，放大倍数：×20。
2.3 MTIS抑制肿瘤细胞增殖
对Caki-1 ccRCC细胞系进行时间梯度CCK-8细胞活性测定，结果显示在72 h的观察期内，MTIS显著抑制了Caki-1细胞的增殖活动，而对照组细胞的增殖则未受到明显影响，表明MTIS具有在特定时间内有效减缓Caki-1肿瘤细胞生长的能力（图5）。
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图5 MTIS对Caki-1细胞增殖的作用
Figure5.The effect of MTIS on the proliferation of Caki-1 cells
注：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
2.4 MTIS抑制肿瘤细胞迁移和侵袭
如图6所示，与PBS组相比，MTIS显著降低了786-O细胞的迁移率和侵袭率，表明MTIS具有抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的作用。
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图6 MTIS对786-O细胞迁移和侵袭能力的作用
Figure6.The effect of MTIS on the migration and invasion ability of 786-O cells
注：标尺：50 μm。
2.5 小鼠动物模型检测MTIS靶向及抑制肿瘤能力
药物在肿瘤组织中的积聚情况是评估其靶向治疗效果的核心指标。通过静脉注射对构建的异种移植瘤小鼠模型给予MTIS后，运用IVIS系统监测其在携带肿瘤的小鼠体内分布情况。结果如图7所示，在小鼠肿瘤区域观察到了强烈的荧光信号，荧光强度随时间推移呈下降趋势，证明了MTIS能有效且精准地靶向肿瘤组织。
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图7 IVIS验证MTIS体内靶向效果（n=3）
Figure7.IVIS verified the targeting effect of MTIS in vivo (n=3)
静脉注射研究结果显示，相较于对照组，接受MTIS治疗的小鼠肿瘤体积在治疗后14 d、21 d和28 d均显著小于对照组，差异具有统计学意义，反映MTIS具有良好的抑制肿瘤生长的能力（图8）。
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图8 小鼠肿瘤体积曲线图
Figure8.Tumor volume curve of mice
注：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
3 讨论
美国癌症协会最新数据显示，肾癌和肾盂癌是十大确诊癌症之一[13-14]。肾癌是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，对医疗保健构成重大威胁[15]。尽管近年来在其分子机制、诊断和治疗上取得了诸多进展，但仍面临许多挑战[16]。手术是RCC的首选治疗手段，然而有20%~40%的RCC患者在接受手术后会遭遇肿瘤的复发与转移。基于放疗和细胞毒性化疗药物的传统治疗方案，对于RCC的疗效并不显著。随着医学的进步，靶向药物应运而生并不断发展，靶向治疗通过精准打击肿瘤细胞的特定分子通路，显著提高了RCC的治疗效果。其中包括针对哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）和酪氨酸激酶受体信号通路的药物，这些新药在治疗RCC方面取得了一定程度的进展，但在使用过程中容易产生耐药性，从而限制了长期的治疗效果[17]，因此，仍需开发新的治疗手段来克服目前的困境。
随着纳米技术时代的来临，纳米探针靶向治疗作为癌症治疗领域的一项革新性突破，尤其在肾癌的治疗上，已取得了较大的研究进展[18]。本研究结果亦发现，MTIS纳米探针可以特异性靶向MN受体，精准识别和结合ccRCC肿瘤细胞；MTIS还可负载荧光染料，在体外细胞实验中，利用CLSM获取的图像清晰揭示了MTIS纳米探针凭借其特异性结构，能精准与MN受体实现特异性结合，且探针上修饰的荧光染料能使肿瘤细胞显影，反映MTIS具有出色的靶向性能。
CCK-8实验结果显示，相较于对照组，MTIS组显著抑制了肾癌细胞的增殖活动，且随着处理时间的延长，MTIS对肾癌细胞增殖的抑制作用持续存在，表现出稳定的抑制效果。而在Transwell实验中，MTIS有效削弱了肾癌细胞的迁移和侵袭能力，具体表现为穿透小室的细胞数量明显减少。MTIS对肿瘤细胞的抑制作用得益于其具有较强的靶向且抑制MN受体的能力。MN是碳酸酐酶家族中的一个异构体，它是一种由酸性氨基酸组成的跨膜糖蛋白，在调节细胞增殖和转化方面扮演着关键角色[19]。MN在多种癌症中高度表达，尤其在宫颈癌中展现出促进细胞转移的重要作用。研究表明，MN的过表达不仅增强了胞外信号调节激酶的磷酸化，诱导上皮间质转化，还促进了细胞的迁移能力[20]。此外，一些研究已观察到MN与多种细胞黏附及迁移相关分子如E- 钙黏蛋白、整合素等潜在的相互作用，从而促进肿瘤细胞迁移[21]。MN与缺氧、酸中毒、侵袭性及治疗耐药性相关，其可通过酶活性或非催化机制对癌症进展产生实质性影响[22]。因此，靶向表达MN的肿瘤细胞有望成为多种治疗环境中的有益策略，并与现有及新型疗法相结合，为ccRCC治疗提供新的视角。
体内实验中，本研究发现MTIS能在小鼠的肿瘤部位形成明显的浓聚，且MTIS组小鼠肿瘤体积显著小于对照组，证明MTIS在抑制肿瘤生长方面具有良好效果。MTIS之所以能在ccRCC的治疗中取得显著成效，主要得益于纳米探针的成像技术、药物递送和靶向治疗作用[23]。这些优势不仅显著提高了治疗效果，还有效降低了对正常组织的毒副作用，为MTIS在临床应用中的广泛推广奠定了坚实的基础。
本研究存在一定局限性，包括使用有限的ccRCC细胞系和小鼠模型可能难以完全代表人类ccRCC和肿瘤微环境；实验技术如CLSM、CCK-8和Transwell实验存在实验条件选择上的局限；MTIS在体内非目标组织中的分布情况以及最佳剂量与给药方案的确定仍需进一步研究等。此外，MTIS作为新型药物输送和诊断工具，在生物安全性方面也存在毒性反应和代谢过快等局限，同时与现有靶向药物相比，存在靶向性不够精准、制备技术复杂、成本较高且稳定性较差等缺点。然而，随着科技的进步和纳米技术的深入研究，这些局限性有望逐步得到克服。
综上所述，MTIS作为新型纳米材料在ccRCC治疗中展现出巨大的潜力，通过精准靶向、多重打击机制、智能递送与释放以及实时影像监测，显著提高了治疗效果，减少了对正常组织的损伤。未来应用前景广阔，包括个性化精准医疗、联合治疗策略、新型纳米材料开发和临床转化与应用等，为肿瘤治疗提供了新的方向和希望。
伦理声明：本研究获得了哈尔滨医科大学附属第四医院伦理委员会审批（批号：2024-DWSYLLCZ-30）
作者贡献：研究设计：祝汉文、王子琦；生物信息学分析：闫溢烁；实验实施：祝汉文、齐鑫；数据收集与整理：祝汉文、闫溢烁、齐鑫；论文撰写：祝汉文；论文修改与指导：李聪、王子琦；资金支持：王子琦
数据获取：本研究中使用和（或）分析的数据已保存于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院分子探针与靶向诊疗重点实验室数据库中，并在论文中得到了完整呈现，如有需要，可联系通信作者根据合理请求提供
利益冲突声明：无
致谢：国家自然科学基金（82171999）提供的资金支持
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