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CYP2C9对肝细胞癌的迁移、侵袭和增殖的影响

发表时间:2024年06月29日阅读量:149次下载量:86次下载手机版

作者: 张拓 李达军 王海涛 张鹏

作者单位: 武汉大学泰康医学院(基础医学院)(武汉 430071)

关键词: CYP2C9 肝细胞癌 迁移 侵袭 增殖

DOI: 10.12173/j.issn.1004-5511.202404060

基金项目: 基金项目: 国家自然科学基金面上项目(81970011)

引用格式:张拓, 李达军, 王海涛, 张鹏. CYP2C9对肝细胞癌的迁移、侵袭和增殖的影响[J]. 医学新知, 2024, 34(6): 674-681. DOI: 10.12173/j.issn.1004-5511.202404060.

Zhang T, Li DJ, Wang HT, Zhang P. Effect of CYP2C9 on the migration, invasion and proliferation of hepatocellular carcinoma cells[J]. Yixue Xinzhi Zazhi, 2024, 34(6): 674-681. DOI: 10.12173/j.issn.1004-5511.202404060.[Article in Chinese]

摘要|Abstract

目的  探究CYP2C9是否参与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的发生发展及其对肝癌细胞迁移、侵袭和增殖的影响。

方法  从TCGA数据库中提取HCC的转录组数据,分析CYP2C9在HCC中的表达和预后相关性;构建HepG2和MHCC97H的CYP2C9稳定过表达细胞系,通过Transwell迁移实验、Transwell 侵袭实验和Western Blot实验分别检测过表达CYP2C9对肝癌细胞系迁移、侵袭能力以及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程的影响;通过CCK-8实验、平板克隆形成实验和Western Blot实验检测过表达CYP2C9对肝癌细胞系增殖能力的影响。

结果  通过生信分析发现,CYP2C9在HCC中的表达显著下调,且CYP2C9的表达与HCC患者的临床预后呈正相关;细胞及分子实验结果显示,过表达CYP2C9显著抑制HepG2细胞和MHCC97H细胞的迁移、侵袭能力和EMT过程,而对细胞的增殖能力没有显著影响。

结论  CYP2C9可能通过抑制肝癌细胞的迁移、侵袭以及EMT过程,进而影响HCC的进展。

全文|Full-text

2020年全球癌症统计数据显示,肝癌在癌症中的发病率和死亡率分别排名第六和第三[1]。大约80%~90%的原发性肝癌是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)[2]。HCC的分布因地域而异,约72%的HCC发生在亚洲[3]。虽然蒙古的HCC发病率最高[4],但由于人口众多,中国的HCC病例数最多[4]。大多数HCC患者预后较差,根治性治疗只能用于少数患者,因为大多数HCC被发现时已经是晚期[5],使得肝癌的治疗充满挑战。尽管基础和临床研究推动了肝癌的靶向治疗,但由于肿瘤切除后复发率高、肿瘤在肝内和肝外转移率高,肝癌仍然是一种死亡率较高的疾病[6-7]。阐明肝癌发生和侵袭转移的潜在分子机制,寻找癌症治疗的新靶点至关重要。

细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)酶超家族是重要的药物代谢酶,负责90%以上外源药物的氧化代谢[8-9],其与癌症风险具有相关性[10]。CYP2C9是人体肝脏中含量最丰富的CYP450酶之一,占肝脏总CYP450蛋白含量的20%,在CYP450酶超家族负责的药物代谢中占15%~20%[11]。在早期食管腺癌中可检测到CYP2C9的异常高表达,CYP2C9可能通过促进食管腺癌细胞的增殖而与早期食管癌发展有关[12]。研究表明,CYP2C9抑制食管鳞状细胞癌的迁移和侵袭[13]。此外,CYP2C9还与HCC的发生发展具有相关性[14-15],但其在HCC中的功能尚未明确。本研究旨在探讨CYP2C9在HCC中的表达及其对HCC的迁移、侵袭和增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

HEK 293T细胞和人源肝癌细胞系HepG2购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection,ATCC),人源肝癌细胞系MHCC97H购自中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)。DMEM高糖培养基(PM150210)、青霉素-链霉素溶液(PB180120)购自普诺赛公司,胎牛血清(FBS-S500)购自NewZerum公司,培养皿购自NEST公司,Transwell小室(3422)购自康宁公司,4%多聚甲醛(G1101)购自赛维尔公司,结晶紫(71012314)购自中国医药集团上海化学试剂公司、CCK-8试剂(C0038)购自碧云天公司。抗体 Cyclin D1(A19038)、PCNA(A12427)、E-Cadherin(A22333)、N-Cadherin(A19083)和β-actin(AC026)抗体均购自爱博泰克公司,FlAG抗体(M185-3L)购自MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD.(MBL)公司,二抗(115-035-003)购自Jackson公司。

1.2 生物信息学分析

在The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库中调取HCC的374个肿瘤样本和50个正常肝脏样本的转录数据,用ggplot2 R包绘制表达箱形图,分析CYP2C9的表达变化;调取HCC中255个I-II期的样本和83个III-IV期的样本、234个G1-G2期样本和127个G3-G4期样本的转录数据,用ggplot2 R包绘制表达箱形图,分析CYP2C9随着肿瘤分期、分级的表达变化;调取HCC中369例HCC患者的生存随访数据,用survival R包进行Kaplan-Meier分析和多因素Cox回归分析,使用survminer R包进行绘图,分析HCC患者的生存时间与CYP2C9表达的相关性。

1.3 质粒构建

人的CYP2C9 DNA片段被克隆连接到phage-3x flag-linker-c载体上,接着被转化到感受态大肠杆菌(生工,B528413)中,菌液被涂布到带有氨卞抗生素的LB固体平板上,在37 ℃恒温培养箱(上海精宏,DNP-9052)中过夜培养,第二天经过菌落PCR,挑选阳性克隆送测序,选择测序正确的克隆提取目的质粒。扩增人的CYP2C9DNA片段所用的引物为:H-CYP2C9-F:TCGGGTTTAAACGGATCCATGGATTCTCTTGTGGTCCTTGTGC;H-CYP2C9-R:GGGCCCTCTAGACTCGAGTCAGACAGGAATGAAGCACAGCTG。

1.4 细胞系构建

293T细胞在10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养,放置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱(松下,MCO-170)中。转移质粒phage-3x flag-CYP2C9、包装质粒pSPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染到6孔板的293T细胞中,6~8 h后换液,换液后48 h收取上清得到2 mL慢病毒。将1 mL病毒和终浓度为10 μg·mL-1的聚凝胺(Polybrene)加入到HepG2或MHCC97H肝癌细胞中,6 h后换液,24 h后消化细胞重新接种,并设立野生型细胞作为对照,用2 μg·mL-1的嘌呤霉素(碧云天,ST551)筛选直到所有对照的野生型细胞被杀死,更换培养基,这时筛选得到能稳定过表达CYP2C9的细胞,并用Western Blot验证稳转细胞系是否构建成功。

1.5 Transwell迁移实验

将Transwell小室置于24孔细胞培养板,上室接种100 μL细胞悬液(不含FBS),密度为8×104个/孔,下室中添加含有10% FBS的600 μL DMEM培养基。将细胞培养板放在培养箱中48 h后,用4%多聚甲醛固定细胞,并用0.2%结晶紫溶液染色,使用棉签去除滤膜顶部的细胞。使用倒置荧光显微镜(MI52-N,成像系统MDX10)随机挑选3个视野观察细胞迁移情况并成像记录。用Image J 1.45计数迁移的细胞数量。

1.6 Transwell侵袭实验

将Transwell小室置于24孔细胞培养板,上室中平铺用DMEM基础培养基稀释的基质胶,并在室温下风干备用。上室接种100 μL细胞悬液(不含FBS),密度为 8×104个/孔,下室中添加含有10% FBS的600 μL DMEM。将细胞培养板放在培养箱中48 h后,用4%多聚甲醛固定细胞,并用0.2%结晶紫溶液染色,使用棉签去除滤膜顶部的细胞。使用倒置荧光显微镜(MI52-N,成像系统MDX10)随机挑选3个视野观察细胞侵袭情况并成像记录。用Image J 1.45计数侵袭的细胞数量。

1.7 平板克隆形成实验

将稳定过表达细胞系接种于6孔板,每孔3  000个细胞。在培养箱中静置培养细胞14 d左右,当对照组大部分单克隆中细胞数大于50时终止细胞培养。4%多聚甲醛固定细胞,0.2%结晶紫溶液染色,用Image J 1.45计数每孔克隆数量。

1.8 CCK-8实验

将稳定过表达细胞系接种于96孔板,每孔3  000个细胞,细胞悬液量为100 μL,复种5孔。并于不同检测时间点(0 h、24 h、48 h、72 h、96 h)将每孔培养基替换为 100μL CCK-8溶液(10 μL CCK-8试剂+90 μL培养基),培养箱内孵育2 h后用酶标仪(Thermo,Multiskan FC)测定各组吸光光度值, 检测波长450 nm。

1.9 Western Blot实验

用120 μL SDS(国药集团化学试剂有限公司,151-21-3)裂解液裂解收集6 cm皿的细胞,将收集到的样品在95 ℃下煮15 min变性蛋白,经过BCA(abbkine亚科因,KTD3001)定量后,每孔上样25 μg蛋白,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完毕后将凝胶中的蛋白转移到PVDF膜(Millipore,IPVH00010)上,5%脱脂牛奶室温封闭1 h,一抗(1 ∶ 1 000)孵育过夜。第二天洗膜后,使用二抗(1 ∶ 25 000)室温孵育PVDF膜1 h,用Tanon5200显影仪成像。用Image J 1.45软件进行蛋白条带的灰度值分析。

1.10 实时荧光定量PCR实验

使用Trizol反应液(T9424,Sigma-Aldrich)提取总RNA,随后用HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(诺唯赞,R323-01)将其逆转录为cDNA,使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞,Q311-02)在Light Cycler 480 Instrument II仪器(Roche)中进行实时荧光定量PCR实验。所用qPCR引物为H-CYP2C9-F:GGACATGAACAACCCTCAGGA;H-CYP2C9-R:TCAACTGCAGTGTTTTCCAAGC。

1.11 统计学分析

使用SPSS 25软件进行统计学分析,GraphPad Prism 8.0软件作图。采用Shapiro- Wilk 检验进行数据正态性检验,所有数据符合正态分布,以均数和标准差()表示。采用t检验评估组间差异,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CYP2C9在HCC组织的表达

为了检测CYP2C9是否参与HCC的发生发展,本研究从TCGA数据库提取HCC的转录组数据进行比较分析,相比于正常肝脏组织样本,CYP2C9的基因表达在HCC组织样本中显著下调(P<0.001,图1-A);从肿瘤的临床分期来看,相比早期(I期至II期)HCC组织样本,晚期(III期至IV期)HCC组织样本CYP2C9基因表达显著下调(P<0.001,图1-B);肿瘤分级体现肿瘤异型性的大小,随着肿瘤分化程度提高,G3-G4级HCC样本中CYP2C9的表达显著低于G1-G2级HCC样本(P<0.001,图1-C)。以上结果表明CYP2C9在HCC中表达显著下调,CYP2C9表达与HCC的肿瘤分期、分级具有负相关性。

  • 图1 CYP2C9在肝细胞癌组织的表达
    Figure1.The expression of CYP2C9 in hepatocellular carcinoma
    注:A.TCGA转录组数据显示CYP2C9在HCC和正常肝脏组织样本中的表达(n=424);B.TCGA转录组数据显示CYP2C9在HCC不同临床分期的表达(n=338);C.TCGA转录组数据显示CYP2C9在HCC不同肿瘤分级的表达(n=361);***P<0.001。

2.2 CYP2C9的表达与HCC患者的临床预后呈正相关

为进一步验证CYP2C9与HCC的相关性,本研究提取TCGA数据库中HCC患者的生存随访数据进行Kaplan-Meier生存分析和多因素Cox回归分析。结果发现CYP2C9低表达患者的总生存期显著低于CYP2C9高表达患者(P<0.001,图2-A),表明CYP2C9的表达与HCC患者的生存时间显著相关。使用多因素Cox回归模型,联合分析了CYP2C9表达和HCC患者的年龄、性别、肿瘤分期、肿瘤分级等因素与HCC患者生存时间的相关性,绘制森林图(图2-B),结果显示CYP2C9的表达[HR=0.92,95%CI(0.85,0.99),P<0.05]是HCC患者预后的保护性因素,提示CYP2C9的表达与肝细胞癌患者的临床预后呈正相关。

  • 图2 CYP2C9的表达与临床预后相关性
    Figure2.The correlation between the expression of CYP2C9 and clinical prognosis
    注:A. Kaplan-Meier分析显示CYP2C9的表达与HCC患者生存时间的相关性(n=369);B. 多因素Cox回归分析显示CYP2C9的表达、HCC患者的年龄、性别、肿瘤分期、肿瘤分级与HCC患者生存时间的相关性(n=313);***P<0.001,*P<0.05。

2.3 CYP2C9对肝癌细胞的迁移、侵袭和增值能力的影响

为了探讨CYP2C9如何调控HCC的发生发展,本研究检测了CYP2C9的过表达对HCC的迁移、侵袭和增殖能力的影响。首先检测了CYP2C9在MHCC97H、HepG2、MHCC97L、Hub7和PLC/PRF/5这5种细胞系中的表达水平,结果显示,CYP2C9在HepG2和MHCC97H这两种肝癌细胞系中的表达相对较低(图3-A)。因此,本研究选择HepG2与MHCC97H构建CYP2C9稳定过表达细胞系来评估CYP2C9对肝癌的影响。将CYP2C9过表达质粒以及相应的空载对照质粒,分别与包装质粒共转到293T细胞中,GFP质粒作为阳性对照,通过观察绿色荧光判断CYP2C9慢病毒质粒和包装质粒的转染情况。转染24 h后,阳性对照组中可观察到70%~80%的细胞有明显的绿色荧光(图3-B),表明质粒顺利转染到293T细胞中。随后将包装成功的慢病毒分别感染HepG2与MHCC97H细胞,感染结束后用2 μg·mL-1的puro筛选,以得到稳定表达目的质粒的细胞。qPCR结果显示在HepG2和MHCC97H两种细胞系中,相对于Ctrl组,CYP2C9显著高表达,Western Blot结果显示用FLAG抗体成功检测到带FLAG标签的CYP2C9蛋白(图3-C、图3-D),表明HepG2和MHCC97H的CYP2C9稳定过表达细胞系构建成功。

  • 图3 CYP2C9稳定过表达的HepG2和MHCC97H细胞系的构建
    Figure3.Construction of HepG2 and MHCC97H cell lines stably expressing CYP2C9
    注:A. qPCR结果显示CYP2C9在MHCC97H、HepG2、MHCC97L、Hub7和PLC/PRF/5中的表达;B.在包装慢病毒过程中,293T细胞转染阳性对照质粒GFP 24 h后,于明场显微镜(左)与荧光显微镜(右)下观察GFP转染效率;C. qPCR和Western Blot显示HepG2细胞系中CYP2C9的过表达;D. qPCR和Western Blot显示MHCC97H细胞系中CYP2C9的过表达。

2.3.1 CYP2C9对肝癌细胞迁移能力的影响

为了检测CYP2C9对肝癌细胞迁移能力的影响,本研究采用HepG2和MHCC97H的CYP2C9稳定过表达细胞系进行迁移实验,结晶紫染色结果显示相比于对照组,两种CYP2C9稳定过表达细胞系迁移的细胞数量减少,迁移能力减弱;定量分析显示HepG2和MHCC97H的CYP2C9稳定过表达细胞系的迁移细胞数量显著低于对照组(P<0.001),表明过表达CYP2C9能显著抑制HepG2和MHCC97H肝癌细胞系的迁移能力(图4-A、图4-B)。

  • 图4 CYP2C9对HepG2和MHCC97H迁移能力的影响
    Figure4.Influence of CYP2C9 on the migration of HepG2 and MHCC97H
    注:A. 结晶紫染色代表性图片显示HepG2的CYP2C9稳定过表达及对照细胞系的迁移实验结果,右侧为迁移实验结果(10x)的定量统计图(n=3);B. 结晶紫染色代表性图片显示MHCC97H的CYP2C9稳定过表达及对照细胞系的迁移实验结果,右侧为迁移实验结果(10x)的定量统计图(n=3);

2.3.2 CYP2C9对肝癌细胞侵袭能力的影响

本研究进一步检测了CYP2C9对肝癌细胞系侵袭能力的影响。HepG2-CYP2C9和MHCC97H-CYP2C9两种肝癌细胞系被用于进行侵袭实验,结晶紫染色结果显示两种CYP2C9稳定过表达细胞系穿过人工基底膜的细胞数量均比对照组少,侵袭能力减弱;定量分析结果显示HepG2和MHCC97H的CYP2C9稳定过表达细胞系穿过人工基底膜的细胞数量显著低于对照组(P<0.001),表明过表达CYP2C9能显著抑制HepG2和MHCC97H肝癌细胞系的侵袭能力(图5-A、图5-B)。

  • 图5 CYP2C9对HepG2和MHCC97H侵袭能力的影响
    Figure5.Influence of CYP2C9 on the invasion of HepG2 and MHCC97H
    注:A. 结晶紫染色代表性图片显示HepG2的CYP2C9稳定过表达及对照细胞系的侵袭实验结果,右侧为侵袭实验结果(10x)的定量统计图(n=3);B. 结晶紫染色代表性图片显示MHCC97H的CYP2C9稳定过表达及对照细胞系的侵袭实验结果,右侧为侵袭实验结果(10x)的定量统计图(n=3);***P<0.001。

2.3.3 CYP2C9对肝癌细胞EMT过程的影响

Western Blot实验检测HepG2和MHCC97H的CYP2C9稳定过表达细胞系的EMT指标E-Cadherin和N-Cadherin的变化,结果显示在HepG2和MHCC97H这两种细胞系中,相比于对照组,CYP2C9过表达均上调了E-Cadherin的表达(P<0.01),同时降低了N-Cadherin的表达(P<0.001),说明过表达CYP2C9显著抑制了HepG2和MHCC97H肝癌细胞系的EMT过程(图6-A、图6-B)。

  • 图6 CYP2C9对HepG2和MHCC97HEMT过程的影响
    Figure6.Influence of CYP2C9 on the EMT process of HepG2 and MHCC97H
    注:A. Western Blot结果及其定量分析显示过表达CYP2C9对HepG2 EMT过程的影响;B. Western Blot结果及其定量分析显示过表达CYP2C9对MHCC97H EMT过程的影响;**P<0.01,***P<0.001。

2.3.4 CYP2C9对肝癌细胞增殖能力的影响

本研究检测了HepG2和MHCC97H的CYP2C9稳定过表达细胞系增殖能力变化。CCK-8实验表明,相比于对照组,在24 h、48 h、72 h和96  h这4个时间点上,CYP2C9稳定过表达细胞系未表现出明显细胞数量的变化(P≥0.05,图7-A);平板克隆形成实验结果表明,相比于对照组,CYP2C9稳定过表达细胞系的克隆数量没有显著变化(P≥0.05,图7-B);Western Blot实验检测PCNA、Cyclin D1增殖指标的变化,结果显示相比于对照组,CYP2C9过表达对PCNA、Cyclin D1的表达没有显著影响(P≥0.05,图7-C)。这些结果表明CYP2C9对HepG2和MHCC97H两种肝癌细胞系的增殖能力没有显著影响(图7-C、图7-D)。

  • 图7 CYP2C9对HepG2和MHCC97H增殖能力的影响
    Figure7.Influence of CYP2C9 on the proliferation of HepG2 and MHCC97H
    注:A. CCK-8实验显示HepG2和MHCC97H的CYP2C9稳定过表达细胞系及其对照细胞系的增殖情况;B. 平板克隆形成实验结果显示HepG2和MHCC97H的CYP2C9稳定过表达细胞系及其对照细胞系的增殖情况(n=3);C. Western Blot结果及其定量分析显示过表达CYP2C9对HepG2增殖能力的影响;D. Western Blot及其定量分析显示过表达CYP2C9对MHCC97H增殖能力的影响;n.s.表示P≥0.05。

3 讨论

本研究发现CYP2C9的表达在HCC组织中显著下调,CYP2C9低表达的HCC患者总生存期要显著低于CYP2C9高表达的HCC患者,表明CYP2C9参与了HCC的发生发展。为进一步探讨CYP2C9在HCC中的作用,本研究检测了过表达CYP2C9对肝癌细胞迁移、侵袭和增殖的影响,结果表明过表达CYP2C9抑制HepG2和MHCC97H的EMT过程,进而抑制迁移和侵袭,但对增殖没有显著影响。以上实验结果揭示了CYP2C9在HCC发展中的重要作用。

癌细胞在组织内的迁移是癌症发展的关键过程[16],当癌症进展和转移时,细胞能够通过单独迁移或集体迁移的方式,扩散到其他器官[17]。除了运动能力外,癌细胞的另一个特性是侵袭性,这为它们提供了攻击性行为。癌细胞分泌的基质金属蛋白酶(MMP)会分解细胞外基质,从肿瘤的原发部位扩散到周围组织,进一步促进癌症进展[18]。而EMT是癌细胞迁移和侵袭的关键过程[19-20]。在EMT期间,上皮细胞丧失极性, E-Cadherin表达下降,进而导致细胞的黏附力降低,使细胞易于侵袭和转移,同时细胞获得间质表型,Vimentin,N-Cadherin等表达升高[21]。本研究发现过表达CYP2C9使HepG2与MHCC97H的迁移和侵袭细胞数显著减少,证实了CYP2C9显著抑制了肝癌细胞系的迁移和侵袭能力。并且过表达CYP2C9还使E-Cadherin表达增加,N-Cadherin表达降低,表明CYP2C9 抑制了EMT过程。有研究报道CYP2C9可以抑制食管鳞状细胞癌的迁移与侵袭能力[13],与本研究结果一致。以上结果提示CYP2C9在调控肿瘤细胞的迁移、侵袭以及EMT过程中具有重要作用。

不受约束的细胞生长在恶性肿瘤的发生和发展中同样起着关键作用[22],但本研究中,CYP2C9对肝癌细胞的增殖没有显著影响,而Schmelzle团队提出,CYP2C9在食管腺癌以及邻近食管黏膜组织的表达较高,并且可通过调节细胞周期促进食管腺癌中的肿瘤细胞增殖[12]。出现不同实验结果的原因,可能与不同肿瘤微环境的变化影响基因表达相关[13]。

以上实验虽然揭示了CYP2C9对肝癌细胞的调控作用,但仍需构建CYP2C9稳定敲低细胞系,反向验证CYP2C9对肝癌细胞系迁移和侵袭的影响。同时构建小鼠肝癌肺转移模型,于体内验证CYP2C9对HCC的影响。此外,CYP2C9如何调控HCC的迁移和侵袭尚不明确,已知几种信号通路,如TGF-β,Wnt/β-catenin,Notch和PI3K/AKT信号通路参与调节EMT[19],其中PI3K/AKT通路在控制肿瘤侵袭和转移方面具有关键意义[21, 23]。CYP2C9是否通过调节PI3K/AKT等信号通路抑制肝癌细胞系的迁移和侵袭,仍需要进一步实验去探讨。

综上所述,本研究揭示了CYP2C9在HCC发展进程中的生物学功能,研究发现CYP2C9在HCC中表达显著下调,CYP2C9的低表达提示HCC的不良预后,表明CYP2C9可能参与了HCC的发生发展;过表达CYP2C9显著抑制HepG2和MHCC97H肝癌细胞系的迁移和侵袭能力以及EMT过程。本研究的结果提示CYP2C9有望成为一个治疗HCC的潜在靶点。

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《医学新知》由国家新闻出版总署批准,中国农工民主党湖北省委主管,武汉大学中南医院和中国农工民主党湖北省委医药卫生工作委员会主办的综合性医学学术期刊,国内外公开发行。

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