2020年全球癌症统计数据显示，肝癌在癌症中的发病率和死亡率分别排名第六和第三[1]。大约80%~90%的原发性肝癌是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[2]。HCC的分布因地域而异，约72%的HCC发生在亚洲[3]。虽然蒙古的HCC发病率最高[4]，但由于人口众多，中国的HCC病例数最多[4]。大多数HCC患者预后较差，根治性治疗只能用于少数患者，因为大多数HCC被发现时已经是晚期[5]，使得肝癌的治疗充满挑战。尽管基础和临床研究推动了肝癌的靶向治疗，但由于肿瘤切除后复发率高、肿瘤在肝内和肝外转移率高，肝癌仍然是一种死亡率较高的疾病[6-7]。阐明肝癌发生和侵袭转移的潜在分子机制，寻找癌症治疗的新靶点至关重要。
细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶超家族是重要的药物代谢酶，负责90%以上外源药物的氧化代谢[8-9]，其与癌症风险具有相关性[10]。CYP2C9是人体肝脏中含量最丰富的CYP450酶之一，占肝脏总CYP450蛋白含量的20%，在CYP450酶超家族负责的药物代谢中占15%~20%[11]。在早期食管腺癌中可检测到CYP2C9的异常高表达，CYP2C9可能通过促进食管腺癌细胞的增殖而与早期食管癌发展有关[12]。研究表明，CYP2C9抑制食管鳞状细胞癌的迁移和侵袭[13]。此外，CYP2C9还与HCC的发生发展具有相关性[14-15]，但其在HCC中的功能尚未明确。本研究旨在探讨CYP2C9在HCC中的表达及其对HCC的迁移、侵袭和增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞及主要试剂
HEK 293T细胞和人源肝癌细胞系HepG2购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC），人源肝癌细胞系MHCC97H购自中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC）。DMEM高糖培养基（PM150210）、青霉素-链霉素溶液（PB180120）购自普诺赛公司，胎牛血清（FBS-S500）购自NewZerum公司，培养皿购自NEST公司，Transwell小室（3422）购自康宁公司，4%多聚甲醛（G1101）购自赛维尔公司，结晶紫（71012314）购自中国医药集团上海化学试剂公司、CCK-8试剂（C0038）购自碧云天公司。抗体 Cyclin D1（A19038）、PCNA（A12427）、E-Cadherin（A22333）、N-Cadherin（A19083）和β-actin（AC026）抗体均购自爱博泰克公司，FlAG抗体（M185-3L）购自MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD.（MBL）公司，二抗（115-035-003）购自Jackson公司。
1.2 生物信息学分析
在The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库中调取HCC的374个肿瘤样本和50个正常肝脏样本的转录数据，用ggplot2 R包绘制表达箱形图，分析CYP2C9的表达变化；调取HCC中255个I-II期的样本和83个III-IV期的样本、234个G1-G2期样本和127个G3-G4期样本的转录数据，用ggplot2 R包绘制表达箱形图，分析CYP2C9随着肿瘤分期、分级的表达变化；调取HCC中369例HCC患者的生存随访数据，用survival R包进行Kaplan-Meier分析和多因素Cox回归分析，使用survminer R包进行绘图，分析HCC患者的生存时间与CYP2C9表达的相关性。
1.3 质粒构建
人的CYP2C9 DNA片段被克隆连接到phage-3x flag-linker-c载体上，接着被转化到感受态大肠杆菌（生工，B528413）中，菌液被涂布到带有氨卞抗生素的LB固体平板上，在37 ℃恒温培养箱（上海精宏，DNP-9052）中过夜培养，第二天经过菌落PCR，挑选阳性克隆送测序，选择测序正确的克隆提取目的质粒。扩增人的CYP2C9DNA片段所用的引物为：H-CYP2C9-F：TCGGGTTTAAACGGATCCATGGATTCTCTTGTGGTCCTTGTGC；H-CYP2C9-R：GGGCCCTCTAGACTCGAGTCAGACAGGAATGAAGCACAGCTG。
1.4 细胞系构建
293T细胞在10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养，放置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱（松下，MCO-170）中。转移质粒phage-3x flag-CYP2C9、包装质粒pSPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染到6孔板的293T细胞中，6~8 h后换液，换液后48 h收取上清得到2 mL慢病毒。将1 mL病毒和终浓度为10 μg·mL-1的聚凝胺（Polybrene）加入到HepG2或MHCC97H肝癌细胞中，6 h后换液，24 h后消化细胞重新接种，并设立野生型细胞作为对照，用2 μg·mL-1的嘌呤霉素（碧云天，ST551）筛选直到所有对照的野生型细胞被杀死，更换培养基，这时筛选得到能稳定过表达CYP2C9的细胞，并用Western Blot验证稳转细胞系是否构建成功。
1.5 Transwell迁移实验
将Transwell小室置于24孔细胞培养板，上室接种100 μL细胞悬液（不含FBS），密度为8×104个/孔，下室中添加含有10% FBS的600 μL DMEM培养基。将细胞培养板放在培养箱中48 h后，用4%多聚甲醛固定细胞，并用0.2%结晶紫溶液染色，使用棉签去除滤膜顶部的细胞。使用倒置荧光显微镜（MI52-N，成像系统MDX10）随机挑选3个视野观察细胞迁移情况并成像记录。用Image J 1.45计数迁移的细胞数量。
1.6 Transwell侵袭实验
将Transwell小室置于24孔细胞培养板，上室中平铺用DMEM基础培养基稀释的基质胶，并在室温下风干备用。上室接种100 μL细胞悬液（不含FBS），密度为 8×104个/孔，下室中添加含有10% FBS的600 μL DMEM。将细胞培养板放在培养箱中48 h后，用4%多聚甲醛固定细胞，并用0.2%结晶紫溶液染色，使用棉签去除滤膜顶部的细胞。使用倒置荧光显微镜（MI52-N，成像系统MDX10）随机挑选3个视野观察细胞侵袭情况并成像记录。用Image J 1.45计数侵袭的细胞数量。
1.7 平板克隆形成实验
将稳定过表达细胞系接种于6孔板，每孔3 000个细胞。在培养箱中静置培养细胞14 d左右，当对照组大部分单克隆中细胞数大于50时终止细胞培养。4%多聚甲醛固定细胞，0.2%结晶紫溶液染色，用Image J 1.45计数每孔克隆数量。
1.8 CCK-8实验
将稳定过表达细胞系接种于96孔板，每孔3 000个细胞，细胞悬液量为100 μL,复种5孔。并于不同检测时间点（0 h、24 h、48 h、72 h、96 h）将每孔培养基替换为 100μL CCK-8溶液（10 μL CCK-8试剂+90 μL培养基），培养箱内孵育2 h后用酶标仪（Thermo，Multiskan FC）测定各组吸光光度值, 检测波长450 nm。
1.9 Western Blot实验
用120 μL SDS（国药集团化学试剂有限公司，151-21-3）裂解液裂解收集6 cm皿的细胞，将收集到的样品在95 ℃下煮15 min变性蛋白，经过BCA（abbkine亚科因，KTD3001）定量后，每孔上样25 μg蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完毕后将凝胶中的蛋白转移到PVDF膜（Millipore，IPVH00010）上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗（1 ∶ 1 000）孵育过夜。第二天洗膜后，使用二抗（1 ∶ 25 000）室温孵育PVDF膜1 h，用Tanon5200显影仪成像。用Image J 1.45软件进行蛋白条带的灰度值分析。
1.10 实时荧光定量PCR实验
使用Trizol反应液（T9424，Sigma-Aldrich）提取总RNA，随后用HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（诺唯赞，R323-01）将其逆转录为cDNA，使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix（诺唯赞，Q311-02）在Light Cycler 480 Instrument II仪器（Roche）中进行实时荧光定量PCR实验。所用qPCR引物为H-CYP2C9-F：GGACATGAACAACCCTCAGGA；H-CYP2C9-R：TCAACTGCAGTGTTTTCCAAGC。
1.11 统计学分析
使用SPSS 25软件进行统计学分析，GraphPad Prism 8.0软件作图。采用Shapiro- Wilk 检验进行数据正态性检验，所有数据符合正态分布，以均数和标准差（
）表示。采用t检验评估组间差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CYP2C9在HCC组织的表达
为了检测CYP2C9是否参与HCC的发生发展，本研究从TCGA数据库提取HCC的转录组数据进行比较分析，相比于正常肝脏组织样本，CYP2C9的基因表达在HCC组织样本中显著下调（P＜0.001，图1-A）；从肿瘤的临床分期来看，相比早期（I期至II期）HCC组织样本，晚期（III期至IV期）HCC组织样本CYP2C9基因表达显著下调（P＜0.001，图1-B）；肿瘤分级体现肿瘤异型性的大小，随着肿瘤分化程度提高，G3-G4级HCC样本中CYP2C9的表达显著低于G1-G2级HCC样本（P＜0.001，图1-C）。以上结果表明CYP2C9在HCC中表达显著下调，CYP2C9表达与HCC的肿瘤分期、分级具有负相关性。
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图1 CYP2C9在肝细胞癌组织的表达
Figure1.The expression of CYP2C9 in hepatocellular carcinoma
注：A.TCGA转录组数据显示CYP2C9在HCC和正常肝脏组织样本中的表达（n=424）；B.TCGA转录组数据显示CYP2C9在HCC不同临床分期的表达（n=338）；C.TCGA转录组数据显示CYP2C9在HCC不同肿瘤分级的表达（n=361）；***P<0.001。
2.2 CYP2C9的表达与HCC患者的临床预后呈正相关
为进一步验证CYP2C9与HCC的相关性，本研究提取TCGA数据库中HCC患者的生存随访数据进行Kaplan-Meier生存分析和多因素Cox回归分析。结果发现CYP2C9低表达患者的总生存期显著低于CYP2C9高表达患者（P＜0.001，图2-A），表明CYP2C9的表达与HCC患者的生存时间显著相关。使用多因素Cox回归模型，联合分析了CYP2C9表达和HCC患者的年龄、性别、肿瘤分期、肿瘤分级等因素与HCC患者生存时间的相关性，绘制森林图（图2-B），结果显示CYP2C9的表达[HR=0.92，95%CI（0.85，0.99），P＜0.05]是HCC患者预后的保护性因素，提示CYP2C9的表达与肝细胞癌患者的临床预后呈正相关。
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图2 CYP2C9的表达与临床预后相关性
Figure2.The correlation between the expression of CYP2C9 and clinical prognosis
注：A. Kaplan-Meier分析显示CYP2C9的表达与HCC患者生存时间的相关性（n=369）；B. 多因素Cox回归分析显示CYP2C9的表达、HCC患者的年龄、性别、肿瘤分期、肿瘤分级与HCC患者生存时间的相关性（n=313）；***P<0.001，*P<0.05。
2.3 CYP2C9对肝癌细胞的迁移、侵袭和增值能力的影响
为了探讨CYP2C9如何调控HCC的发生发展，本研究检测了CYP2C9的过表达对HCC的迁移、侵袭和增殖能力的影响。首先检测了CYP2C9在MHCC97H、HepG2、MHCC97L、Hub7和PLC/PRF/5这5种细胞系中的表达水平，结果显示，CYP2C9在HepG2和MHCC97H这两种肝癌细胞系中的表达相对较低（图3-A）。因此，本研究选择HepG2与MHCC97H构建CYP2C9稳定过表达细胞系来评估CYP2C9对肝癌的影响。将CYP2C9过表达质粒以及相应的空载对照质粒，分别与包装质粒共转到293T细胞中，GFP质粒作为阳性对照，通过观察绿色荧光判断CYP2C9慢病毒质粒和包装质粒的转染情况。转染24 h后，阳性对照组中可观察到70%~80%的细胞有明显的绿色荧光（图3-B），表明质粒顺利转染到293T细胞中。随后将包装成功的慢病毒分别感染HepG2与MHCC97H细胞，感染结束后用2 μg·mL-1的puro筛选，以得到稳定表达目的质粒的细胞。qPCR结果显示在HepG2和MHCC97H两种细胞系中，相对于Ctrl组，CYP2C9显著高表达，Western Blot结果显示用FLAG抗体成功检测到带FLAG标签的CYP2C9蛋白（图3-C、图3-D），表明HepG2和MHCC97H的CYP2C9稳定过表达细胞系构建成功。
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图3 CYP2C9稳定过表达的HepG2和MHCC97H细胞系的构建
Figure3.Construction of HepG2 and MHCC97H cell lines stably expressing CYP2C9
注：A. qPCR结果显示CYP2C9在MHCC97H、HepG2、MHCC97L、Hub7和PLC/PRF/5中的表达；B.在包装慢病毒过程中，293T细胞转染阳性对照质粒GFP 24 h后，于明场显微镜（左）与荧光显微镜（右）下观察GFP转染效率；C. qPCR和Western Blot显示HepG2细胞系中CYP2C9的过表达；D. qPCR和Western Blot显示MHCC97H细胞系中CYP2C9的过表达。
2.3.1 CYP2C9对肝癌细胞迁移能力的影响
为了检测CYP2C9对肝癌细胞迁移能力的影响，本研究采用HepG2和MHCC97H的CYP2C9稳定过表达细胞系进行迁移实验，结晶紫染色结果显示相比于对照组，两种CYP2C9稳定过表达细胞系迁移的细胞数量减少，迁移能力减弱；定量分析显示HepG2和MHCC97H的CYP2C9稳定过表达细胞系的迁移细胞数量显著低于对照组（P＜0.001），表明过表达CYP2C9能显著抑制HepG2和MHCC97H肝癌细胞系的迁移能力（图4-A、图4-B）。
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图4 CYP2C9对HepG2和MHCC97H迁移能力的影响
Figure4.Influence of CYP2C9 on the migration of HepG2 and MHCC97H
注：A. 结晶紫染色代表性图片显示HepG2的CYP2C9稳定过表达及对照细胞系的迁移实验结果，右侧为迁移实验结果（10x）的定量统计图（n=3）；B. 结晶紫染色代表性图片显示MHCC97H的CYP2C9稳定过表达及对照细胞系的迁移实验结果，右侧为迁移实验结果（10x）的定量统计图（n=3）；
2.3.2 CYP2C9对肝癌细胞侵袭能力的影响
本研究进一步检测了CYP2C9对肝癌细胞系侵袭能力的影响。HepG2-CYP2C9和MHCC97H-CYP2C9两种肝癌细胞系被用于进行侵袭实验，结晶紫染色结果显示两种CYP2C9稳定过表达细胞系穿过人工基底膜的细胞数量均比对照组少，侵袭能力减弱；定量分析结果显示HepG2和MHCC97H的CYP2C9稳定过表达细胞系穿过人工基底膜的细胞数量显著低于对照组（P＜0.001），表明过表达CYP2C9能显著抑制HepG2和MHCC97H肝癌细胞系的侵袭能力（图5-A、图5-B）。
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图5 CYP2C9对HepG2和MHCC97H侵袭能力的影响
Figure5.Influence of CYP2C9 on the invasion of HepG2 and MHCC97H
注：A. 结晶紫染色代表性图片显示HepG2的CYP2C9稳定过表达及对照细胞系的侵袭实验结果，右侧为侵袭实验结果（10x）的定量统计图（n=3）；B. 结晶紫染色代表性图片显示MHCC97H的CYP2C9稳定过表达及对照细胞系的侵袭实验结果，右侧为侵袭实验结果（10x）的定量统计图（n=3）；***P<0.001。
2.3.3 CYP2C9对肝癌细胞EMT过程的影响
Western Blot实验检测HepG2和MHCC97H的CYP2C9稳定过表达细胞系的EMT指标E-Cadherin和N-Cadherin的变化，结果显示在HepG2和MHCC97H这两种细胞系中，相比于对照组，CYP2C9过表达均上调了E-Cadherin的表达（P＜0.01），同时降低了N-Cadherin的表达（P＜0.001），说明过表达CYP2C9显著抑制了HepG2和MHCC97H肝癌细胞系的EMT过程（图6-A、图6-B）。
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图6 CYP2C9对HepG2和MHCC97HEMT过程的影响
Figure6.Influence of CYP2C9 on the EMT process of HepG2 and MHCC97H
注：A. Western Blot结果及其定量分析显示过表达CYP2C9对HepG2 EMT过程的影响；B. Western Blot结果及其定量分析显示过表达CYP2C9对MHCC97H EMT过程的影响；**P<0.01，***P<0.001。
2.3.4 CYP2C9对肝癌细胞增殖能力的影响
本研究检测了HepG2和MHCC97H的CYP2C9稳定过表达细胞系增殖能力变化。CCK-8实验表明，相比于对照组，在24 h、48 h、72 h和96 h这4个时间点上，CYP2C9稳定过表达细胞系未表现出明显细胞数量的变化（P≥0.05，图7-A）；平板克隆形成实验结果表明，相比于对照组，CYP2C9稳定过表达细胞系的克隆数量没有显著变化（P≥0.05，图7-B）；Western Blot实验检测PCNA、Cyclin D1增殖指标的变化，结果显示相比于对照组，CYP2C9过表达对PCNA、Cyclin D1的表达没有显著影响（P≥0.05，图7-C）。这些结果表明CYP2C9对HepG2和MHCC97H两种肝癌细胞系的增殖能力没有显著影响（图7-C、图7-D）。
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图7 CYP2C9对HepG2和MHCC97H增殖能力的影响
Figure7.Influence of CYP2C9 on the proliferation of HepG2 and MHCC97H
注：A. CCK-8实验显示HepG2和MHCC97H的CYP2C9稳定过表达细胞系及其对照细胞系的增殖情况；B. 平板克隆形成实验结果显示HepG2和MHCC97H的CYP2C9稳定过表达细胞系及其对照细胞系的增殖情况（n=3）；C. Western Blot结果及其定量分析显示过表达CYP2C9对HepG2增殖能力的影响；D. Western Blot及其定量分析显示过表达CYP2C9对MHCC97H增殖能力的影响；n.s.表示P≥0.05。
3 讨论
本研究发现CYP2C9的表达在HCC组织中显著下调，CYP2C9低表达的HCC患者总生存期要显著低于CYP2C9高表达的HCC患者，表明CYP2C9参与了HCC的发生发展。为进一步探讨CYP2C9在HCC中的作用，本研究检测了过表达CYP2C9对肝癌细胞迁移、侵袭和增殖的影响，结果表明过表达CYP2C9抑制HepG2和MHCC97H的EMT过程，进而抑制迁移和侵袭，但对增殖没有显著影响。以上实验结果揭示了CYP2C9在HCC发展中的重要作用。
癌细胞在组织内的迁移是癌症发展的关键过程[16]，当癌症进展和转移时，细胞能够通过单独迁移或集体迁移的方式，扩散到其他器官[17]。除了运动能力外，癌细胞的另一个特性是侵袭性，这为它们提供了攻击性行为。癌细胞分泌的基质金属蛋白酶（MMP）会分解细胞外基质，从肿瘤的原发部位扩散到周围组织，进一步促进癌症进展[18]。而EMT是癌细胞迁移和侵袭的关键过程[19-20]。在EMT期间，上皮细胞丧失极性， E-Cadherin表达下降，进而导致细胞的黏附力降低，使细胞易于侵袭和转移，同时细胞获得间质表型，Vimentin，N-Cadherin等表达升高[21]。本研究发现过表达CYP2C9使HepG2与MHCC97H的迁移和侵袭细胞数显著减少，证实了CYP2C9显著抑制了肝癌细胞系的迁移和侵袭能力。并且过表达CYP2C9还使E-Cadherin表达增加，N-Cadherin表达降低，表明CYP2C9 抑制了EMT过程。有研究报道CYP2C9可以抑制食管鳞状细胞癌的迁移与侵袭能力[13]，与本研究结果一致。以上结果提示CYP2C9在调控肿瘤细胞的迁移、侵袭以及EMT过程中具有重要作用。
不受约束的细胞生长在恶性肿瘤的发生和发展中同样起着关键作用[22]，但本研究中，CYP2C9对肝癌细胞的增殖没有显著影响，而Schmelzle团队提出，CYP2C9在食管腺癌以及邻近食管黏膜组织的表达较高，并且可通过调节细胞周期促进食管腺癌中的肿瘤细胞增殖[12]。出现不同实验结果的原因，可能与不同肿瘤微环境的变化影响基因表达相关[13]。
以上实验虽然揭示了CYP2C9对肝癌细胞的调控作用，但仍需构建CYP2C9稳定敲低细胞系，反向验证CYP2C9对肝癌细胞系迁移和侵袭的影响。同时构建小鼠肝癌肺转移模型，于体内验证CYP2C9对HCC的影响。此外，CYP2C9如何调控HCC的迁移和侵袭尚不明确，已知几种信号通路，如TGF-β，Wnt/β-catenin，Notch和PI3K/AKT信号通路参与调节EMT[19]，其中PI3K/AKT通路在控制肿瘤侵袭和转移方面具有关键意义[21, 23]。CYP2C9是否通过调节PI3K/AKT等信号通路抑制肝癌细胞系的迁移和侵袭，仍需要进一步实验去探讨。
综上所述，本研究揭示了CYP2C9在HCC发展进程中的生物学功能，研究发现CYP2C9在HCC中表达显著下调，CYP2C9的低表达提示HCC的不良预后，表明CYP2C9可能参与了HCC的发生发展；过表达CYP2C9显著抑制HepG2和MHCC97H肝癌细胞系的迁移和侵袭能力以及EMT过程。本研究的结果提示CYP2C9有望成为一个治疗HCC的潜在靶点。
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