胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是中枢神经系统中最具侵袭性的神经胶质瘤，最大限度的手术切除、化疗、放疗是目前GBM的标准治疗手段，但由于中枢神经系统独特的免疫环境，导致免疫治疗在GBM中的应用面临重大挑战。目前免疫治疗策略以免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）为主，明确ICIs在GBM中的作用机制，开发有效的治疗靶点，对延长GBM患者的生存期具有重要意义。本研究对血脑屏障、肿瘤微环境、免疫细胞、ICIs及其联合疗法在GBM中的研究进展进行概述，以期为GBM免疫治疗提供参考。

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是成人中最常见和最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤 [1]，尽管仅占所有成人癌症的约2%，但WHO将GBM列为IV级肿瘤，是最致命的肿瘤之一，其治疗仍然是一项重大挑战[2]。GBM是一种遗传和功能异质性肿瘤，其中一部分肿瘤干细胞表现出自我更新能力和对标准治疗的抵抗力。免疫疗法对癌细胞具有一定的靶向选择性，杀死癌细胞的同时保留正常脑组织[3]，成为GBM的一种潜在治疗策略。免疫系统通过诱导免疫检查点的表达维持免疫细胞之间的平衡，调节宿主免疫，从而促进了免疫检查点靶向疗法的发展。目前多种免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）被应用于包括GBM在内的恶性肿瘤治疗中[4],明确ICIs在GBM中的作用机制，开发有效的治疗靶点，对延长GBM患者的生存期具有重要意义。本研究对GBM中血脑屏障、肿瘤微环境、免疫细胞、ICIs及其联合疗法的研究进展进行概述，以期为GBM免疫治疗提供参考。

1 GBM与血脑屏障

血脑屏障具有保护大脑不受病原体侵袭、控制免疫调节等功能，其促进了离子、神经递质和营养物质的转运，同时保护中枢神经系统免受神经毒素和大多数大分子的侵害[5]，但其也会阻碍大分子或水溶性药物和免疫效应细胞进入颅内，这对依赖于将抗体有效递送至肿瘤的系统性免疫疗法提出了重大挑战。脑肿瘤治疗成功的标志之一是血脑屏障完整性的丧失和紧密连接通透性的增加[6]。同时需要注意的是，虽然血脑屏障完整性的丧失有利于药物递送，特别是对依赖于外周免疫细胞募集的药物，但完整性的丧失也可能促进促肿瘤发生细胞（如外周来源的免疫抑制巨噬细胞）的浸润来增强致瘤性[7]。但GBM的特定区域内血脑屏障并未完全受到破坏而保持完好无损，使血脑屏障这把双刃剑的应用变得更加复杂[8]，GBM的治疗必须能够克服这些复杂的局限性才能有效。

2 GBM与肿瘤微环境

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）由基质细胞、信号分子、免疫细胞和周围的细胞外基质等组成。GBM的TME是免疫抑制微环境 [9]，其TME内不同细胞群之间复杂的相互作用有助于建立缺氧和坏死的肿瘤区域，但同时也会造成对放化疗的抵抗[10]。例如，Wu等[11]通过使用多焦点样本研究GBM的自然进化轨迹，对来自8个多灶性异柠檬酸脱氢酶野生型原发性GBM的61 062个单细胞进行了测序，并定义了肿瘤的自然进化特征（natural evolution signature，NES），发现NES与调节大脑发育的转录因子（包括MYBL2和FOSL2）的激活显著相关。缺氧可通过激活HIF1A-FOSL2轴参与诱导NES转变，高NES肿瘤细胞可通过激活骨髓来源的巨噬细胞来募集和极化FOSL2-ANXA1-FPR1/3轴，这些极化的巨噬细胞可有效抑制T细胞活性并加速肿瘤细胞中的NES转变；同时，极化的巨噬细胞可以上调CCL2以诱导肿瘤细胞迁移[11]。这项研究表明，缺氧可通过HIF1A-FOSL2轴诱导GBM进展，肿瘤源性ANXA1与骨髓源性巨噬细胞的招募和极化相关，可以抑制GBM的TME[11]。

此外，也有研究表明，GBM的免疫抑制微环境增强了免疫抑制细胞，例如，肿瘤相关巨噬细胞、调节性T细胞以及骨髓源性抑制细胞的诱导，从而使GBM细胞能够逃避宿主肿瘤监视机制并促进疾病进展[12]。因此，TME在GBM的发生发展过程中起到了类似“促癌因子”的作用。

3 GBM与免疫细胞

肿瘤组织的很大一部分由免疫细胞组成，其中肿瘤相关骨髓细胞（tumor-associated myeloid cells，TAMC）占肿瘤体积的50%，其余主要的免疫细胞还包括肿瘤相关中性粒细胞（tumor-associated neutrophils，TANs）、Foxp3+调节性T细胞（Foxp3+ regulatory T cells）、自然杀伤细胞（natural killer cells，NKs）、树突状细胞（dendritic cells，DCs）、B细胞。这些肿瘤免疫细胞大多起源于外周而非中枢神经系统[13]。与GBM有关的几种免疫细胞及其功能或意义见表1。

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  表格1 与胶质母细胞瘤有关的免疫细胞及其功能或意义

  Table1.Immune cells and their functions or significance associated with glioblastoma

  注：TAMC：肿瘤相关骨髓细胞；TANs：肿瘤相关中性粒细胞；NKs：自然杀伤细胞；DCs：树突状细胞。

  

4 ICIs

免疫检查点是共抑制分子，可以减弱T细胞介导的免疫反应的强度和持续时间，以维持自我耐受并防止不受控制的炎症反应[31]。目前，在血液学和实体瘤中研究最多的共抑制分子包括程序性死亡受体1（PD-1）及其配体PD-L1、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3（TIM-3）、淋巴细胞激活基因3（LAG-3）、吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）、T细胞免疫受体（TIGIT）、肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族中的CD137和唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglecs）。但免疫检查点阻断在GBM治疗中收效甚微，ICIs与其他免疫刺激剂的联合治疗是许多正在进行的临床试验的重点[32]。

4.1 PD-1/PD-L1检查点抑制剂

研究表明，GBM肿瘤细胞中的PD-L1表达与恶性程度和肿瘤侵袭性水平相对应，可能会增加免疫逃避的风险，并可预测GBM预后[33]。研究表明，PD-1/PD-L1检查点阻断显著改变了晚期非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤等多种癌症的治疗模式，ICIs在GBM中的应用研究也较多[34]。虽然多项临床试验探索了PD-1和PD-L1抑制剂治疗GBM的效果，且检查点联合阻断免疫疗法已在临床前GBM小鼠模型中显示出显著疗效[35]，但PD-1/PD-L1检查点抑制剂在GBM中的临床疗效仍存在争议。

GBM的免疫抑制特性可能会阻碍各种抗PD-L1/PD-1治疗的功效。有临床报告报道抗PD-1/PD-L1作为单一疗法对GBM患者的疗效有限[36]。CheckMate-143试验是首个提出使用PD-1抑制剂纳武单抗治疗GBM患者的III期研究，但纳武单抗与贝伐珠单抗两个治疗组的中位总生存期（overall survival，OS）相当，未显示出临床应用价值[37]。CheckMate-498试验评估了新诊断的6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）未甲基化的GBM患者手术切除肿瘤后，纳武单抗联合放疗与替莫唑胺（TMZ）联合放疗的效果[38]。CheckMate-548试验评估了新诊断的MGMT甲基化GBM患者在手术切除肿瘤后，纳武单抗联合TMZ、放疗与安慰剂联合TMZ、放疗的效果[39]。但CheckMate-498和CheckMate-548试验均未能延长患者的OS。尽管如此，PD-1检查点抑制剂目前已被批准用于治疗微卫星不稳定性高、错配修复缺陷或肿瘤突变负荷高的实体瘤，包括GBM[40]。

4.2 CTLA-4检查点抑制剂

CTLA-4是一种蛋白受体，作为免疫检查点起作用并下调免疫应答。当T细胞被激活时，CTLA-4的表达明显上调，其与CD28共同享有B7分子配体，且CTLA-4与B7分子结合后诱导T细胞无反应性。Reardon等[41]通过抗CTLA-4和抗PD-1的组合疗法治愈了75%的GBM小鼠，并激发肿瘤特异性免疫反应，该结果表明，通过共同阻断PD-1和CTLA-4检查点，可以消除对T淋巴细胞功能的抑制。与低级别胶质瘤相比，CTLA-4的表达在高级别胶质瘤中更高，表明CTLA-4的表达与肿瘤分级呈正相关[42]。目前，有多项临床试验正研究抗CTLA-4对GBM的治疗效果。例如，一项抗CTLA-4的II期临床试验比较单独TMZ治疗与TMZ联合伊匹单抗治疗放化疗后的GBM患者的疗效[43]。一项II/III期临床试验比较TMZ联合伊匹单抗与TMZ联合纳武单抗治疗新诊断的MGMT非甲基化GBM患者中的疗效[44]。这些临床试验均有望为CTLA-4检查点抑制剂治疗GBM提供依据。

4.3 TIM-3检查点抑制剂

TIM-3是CD4⁺T辅助细胞1和CD8⁺T细胞毒性细胞选择性表达的抑制性受体和表面蛋白，可以引发肿瘤进展和慢性病毒感染中的T细胞衰竭[45]。TIM-3除了可作为T细胞耗竭的标志，还可以作为恢复T细胞活力的治疗靶点。Guo等[46]证明，TIM-3是GBM中肿瘤细胞和非肿瘤细胞共享的共抑制免疫检查点，除了免疫细胞外，还有肿瘤细胞也表达TIM-3，这表明TIM-3是胶质瘤和免疫细胞共享的共同信号通路。胶质瘤细胞固有的TIM-3不仅参与调节胶质瘤细胞的恶性行为，还通过TIM-3/白细胞介素6（IL-6）信号诱导巨噬细胞迁移并转变为促肿瘤表型。故TIM-3过表达增强了胶质瘤细胞的侵袭和迁移，并增加了它们在体内的致瘤性，表明TIM-3在胶质瘤细胞恶性生物学行为中具有调控作用。目前，临床试验正在探索抗TIM-3疗法用于多种肿瘤的临床适应证，包括针对GBM的I期临床试验（NCT03961971），该试验旨在确定抗TIM-3联合抗PD-1和立体定向放射外科治疗复发性GBM患者的安全性[47]。

4.4 LAG-3检查点抑制剂

与PD-1类似，LAG-3也是表达在T细胞、B细胞、NKs和DCs表面的免疫检查点蛋白。LAG-3通过与II类主要组织相容性复合体（MHC II）结合以降低T细胞活性[48]。抑制LAG-3能够让T细胞重新获得细胞毒性活性，降低调节性T细胞抑制免疫反应的功能。LAG-3作为重要的肿瘤免疫检查点，可能与PD-1/PD-L1通路有协同作用[49]。在GBM中，一项使用同基因小鼠模型的临床前研究表明，单独使用抗LAG-3抗体或与抗PD-1抗体联合使用可延长小鼠生存期[50]。目前，针对复发性GBM患者的I期临床试验（NCT02658981）正在研究单独使用抗LAG-3单克隆抗体BMS-986016或与纳武单抗联合使用的安全性和最佳剂量，现尚不清楚抗LAG-3对GBM的治疗效果。但Mair等[51]研究也发现，LAG-3仅在少量人类神经胶质瘤样本中表达，且LAG-3在炎症微环境中的表达显示出相当大的异质性。因此，可能只有小部分GBM患者能够受益于LAG-3检查点抑制剂治疗，有必要继续研究抗LAG-3在GBM患者的临床疗效，并探索新的生物标志物来识别受益于LAG-3阻断的GBM患者。

4.5 IDO检查点抑制剂

IDO是一种细胞内酶，能够抑制T细胞增殖并导致T细胞凋亡和调节性T细胞积累。Zhai等[52]证明IDO在GBM细胞样本中过表达，并且IDO上调与患者不良预后显著相关。IDO负责介导肿瘤对PD-1/PD-L1或CTLA-4检查点阻断的适应性抵抗。因此，靶向IDO可能是增强PD-1/PD-L1或CTLA-4检查点抑制剂临床疗效的潜在策略。IDO可以通过调节T细胞反应来阻碍针对GBM的有效免疫，不仅可以增加细胞毒性T淋巴细胞的凋亡，还可以将幼稚T细胞转化为可诱导的免疫抑制调节性T细胞[53]。当GBM肿瘤细胞被浸润性T细胞或NKs识别并暴露于IFN-γ、TNF-α等抗癌细胞因子时，IDO会被激活，此时肿瘤内IDO的表达增加[54]，故GBM浸润性T细胞和NKs水平的增加可能导致GBM患者总体存活率下降。以上表明，IDO抑制剂可能是提高GBM患者存活率的有价值的治疗靶点。

4.6 TIGIT检查点抑制剂

TIGIT是具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体，是一种仅在淋巴细胞（主要是T细胞和NKs）中表达的共抑制分子。多项临床前研究表明，抗TIGIT抗体作为单一疗法或与PD-1和TIM-3抑制剂联合使用，可以直接抑制T细胞增殖并改善抗肿瘤免疫反应[55]。研究发现，与健康个体相比，GBM患者肿瘤部位CD8⁺T细胞中TIGIT的表达上调[56]。Hung等[57]研究发现，TIGIT配体脊髓灰质炎病毒受体的表达与神经胶质瘤患者的生存率较低有关，在GBM小鼠模型中，与单一疗法相比，抗TIGIT与抗PD-1联合治疗可以提高小鼠生存率，这一观察结果与效应T细胞活性的增加和调节性T细胞的下调相关。因此，TIGIT为GBM患者的免疫治疗提供了一个有前景的靶点。目前，一项多中心I期临床试验（NCT04656535）正在研究使用抗TIGIT联合抗PD-1抗体治疗复发性GBM患者的效果。

4.7 CD137检查点抑制剂

CD137是一种共刺激分子，参与免疫细胞激活的调节，包括CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、NKs和DCs的激活。CD137可以介导和增强CD8⁺T细胞的细胞毒性，它通过与其配体4-1BB-L结合而发出信号，为CD8⁺T细胞提供共刺激信号。使用人类神经胶质瘤的体外模型，在抗CD137存在的情况下，用肿瘤裂解物脉冲的DC引发的外周血单核细胞（PBMC）会诱导IFN-γ的产生；此外，当与抗CD137抗体一起孵育时，由CD4⁺和CD8⁺T细胞介导的PBMC的细胞毒性增强[58]。这一观察结果得到了一项体内研究的支持，该研究表明抗CD137可以增强神经胶质瘤模型的抗肿瘤功效[59]。目前，一项Ⅰ期临床试验（NCT02658981）正在评估抗CD137作为单一疗法治疗复发性GBM患者的效果。

4.8 Siglecs检查点抑制剂

唾液酸失调与肿瘤的发生发展密切相关。Siglecs是一类识别唾液酸的受体，主要在白细胞表面表达，对于免疫介导的自身抗原和非自身抗原的区分至关重要，并表现出免疫检查点抑制活性[60]。据报道，Siglecs可作为免疫监视的调节剂，在癌症免疫治疗中具有潜在的应用[61]。当恶性细胞出现高唾液酸化时，免疫细胞与抑制性Siglecs的结合随之增强，从而使免疫抑制永久化[62]。一些针对特定Siglecs的免疫检查点抑制剂已进入临床试验。例如，Mei等[63]对接受新辅助抗PD-1治疗的GBM患者进行了单细胞RNA测序和空间转录组学研究，鉴定了具有功能可塑性的单核细胞来源的肿瘤相关巨噬细胞亚群，它们高度表达免疫抑制Siglecs基因，并优先在抗PD-1治疗无反应者中积累。Siglecs（鼠同源物）的缺失可显著抑制GBM小鼠模型中的肿瘤发展并延长生存期[64]。从机制上来说，靶向Siglecs直接激活了CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞通过抗原呈递、分泌趋化因子和共刺激因子相互作用[65]。此外，Mei等[63]还证明Siglecs缺失与抗PD-1/PD-L1治疗具有协同作用，可提高抗肿瘤疗效，这表明，Siglecs是巨噬细胞上的一种免疫检查点分子，可以靶向增强抗PD-1/PD-L1治疗GBM的效果。

5 免疫检查点阻断与其他联合疗法

由于免疫逃逸等原因，只有小部分患者从免疫检查点阻断中获得了持久益处。一些研究开始探索表观遗传调控、肿瘤电场治疗等疗法与免疫检查点阻断联合治疗GBM患者。

5.1 表观遗传调控与免疫检查点阻断

GBM的TME中存在胶质瘤干细胞（glioma stem cells，GSC），GSC的可塑性使它们能够适应不同的TME并在治疗后持续存在。GSC被分为两种分子亚型：原神经亚型和间充质亚型，后者表现出更具攻击性的表型。TME和治疗可以诱导原神经亚型向间充质亚型转变，以作为一种适应和抵抗治疗的机制。此外，GSC可以在静止和增殖亚状态之间转换，使它们能够持续存在于不同的生态位并适应肿瘤进展的不同阶段[66]。而GSC适应每个生态位的表型灵活性是通过动态表观遗传修饰来调节的[67]。GSC中的甲基化酶、去甲基化酶和组蛋白脱乙酰酶失调，使它们能够解锁细胞生存和可塑性所必需的转录程序。GSC的表观遗传改变对于GSC干性和治疗耐药性很重要[68]。因此，动态调节GSC转录程序及其可塑性的分子靶向疗法已成为一种新的替代治疗方案。

在一项研究中[69]，研究者将表观遗传调控与免疫检查点阻断相结合，该策略增加了肿瘤抗原水平，同时增强了抗原呈递细胞呈递抗原的能力并逆转T细胞耗竭，从而缓解了这种免疫逃逸机制。在这项研究中，PPD（mPEG-b-PLG/PEI-RT3/DNA）被开发用于介导质粒编码shPD-L1的递送，通过引入多重相互作用（即静电、氢键和疏水相互作用）和聚脯氨酸II螺旋构象，下调肿瘤细胞上的PD-L1表达以缓解T细胞的免疫抑制。Zebularine是一种DNA甲基转移酶抑制剂，用于TME的表观遗传调节，从而诱导DC成熟和MHC I类分子表达以增强抗原呈递[70]。PPD与Zebularine联合疗法启动全身抗肿瘤免疫反应，通过产生持久的免疫记忆有效预防复发和转移[69]。该策略为GBM治疗和抑制复发转移提供了新方案。

5.2 肿瘤电场治疗与免疫检查点阻断

肿瘤电场治疗（tumor-treating fields，TTFields）是一种无创治疗方式，在肿瘤局部区域施加低强度、中频、交变电场，可抑制肿瘤细胞有丝分裂和细胞周期，诱导癌细胞自噬，扰乱DNA修复，破坏细胞迁移，从而抑制肿瘤生长和侵袭[71]。尽管这种治疗方式具有局部区域性质，但既往研究表明TTFields可以发挥远隔效应，诱导免疫介导的抗肿瘤反应[72]。研究表明TTFields可能在体外诱导免疫原性细胞死亡并通过为DCs提供炎症刺激来启动适应性免疫[73]。由于抗癌免疫反应是TTFields的下游效应，因此这种治疗方式可能是与ICIs联合使用的潜在候选者。目前，TTFields联合抗PD-1已在非小细胞肺癌的临床研究中显示出体内疗效[74]。在该临床研究中，TTFields首次被证明可以在体内诱导免疫原性细胞死亡，并且与抗PD-1、抗CTLA-4或抗PD-L1联合治疗有效，支持TTFields疗法在治疗中的新兴潜力[75]。因此，TTFields联合ICIs为治疗GBM提供了新的可能性。

6 结语

肿瘤免疫治疗领域正在迅速发展，以满足不同癌症类型的独特要求和挑战。免疫疗法彻底改变了非小细胞肺癌、黑色素瘤等癌症的临床管理。对于GBM来说，常规疗法为患者提供的益处有限，虽然几种ICIs在神经胶质瘤临床前研究中显示出前景，但临床试验结果表明效果仍然有限。

未来应进一步研究GBM的特异性TME以及其与GBM细胞之间复杂的相互作用对免疫治疗反应的潜在影响，重点关注ICIs反应生物标志物及外周免疫细胞对治疗反应的潜在贡献，以创建一种能够克服耐药机制并在GBM患者中疗效更佳的方法。目前，GBM的治疗趋向于联合治疗，就免疫检查点阻断来说，单纯靶向ICIs已无法满足临床需求，免疫检查点阻断与表观遗传调控、TTFields等其他疗法的联合应用有望在GBM治疗中发挥作用，为GBM突破传统治疗方式带来新希望。

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