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miR-222-3p对口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

发表时间:2023年10月25日阅读量:707次下载量:247次下载手机版

作者: 杨淑银 岳二丽 郭留云 陆珂 杨梦宇

作者单位: 郑州大学第一附属医院牙周科(郑州 450000)

关键词: 口腔鳞状细胞癌 微小RNA -222-3p CAL-27细胞 增殖 凋亡 侵袭

DOI: 10.12173/j.issn.1004-5511.202302031

基金项目: 基金项目: 河南省高等学校重点科研项目计划(20B320053)

引用格式:杨淑银,岳二丽, 郭留云, 陆珂, 杨梦宇. miR-222-3p对口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞增殖、凋亡和侵袭的影响[J]. 医学新知, 2023, 33(5): 343-349. DOI: 10.12173/j.issn.1004-5511.202302031.

Yang SY, Yue EL Guo LY, Lu K, Yang MY. Effects of miR-222-3p on proliferation, apoptosis and invasion of oral squamous cell carcinoma CAL-27 cells[J]. Yixue Xinzhi Zazhi, 2023, 33(5): 343-349. DOI: 10.12173/j.issn.1004-5511.202302031. [Article in Chinese]

摘要|Abstract

目的  探讨微小RNA-222-3p(miR-222-3p)对口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。

方法  采用qRT-PCR检测口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞和正常口腔角质细胞株(hNOK)中miR-222-3p的表达,培养CAL-27细胞并分为对照组(NC组)、inhibitor NC组(转染阴性对照质粒)和miR-222-3p inhibitor组(转染miR-222-3p inhibitor)。分别采用MTT法、流式细胞术及Trasnwell法检测细胞增殖、凋亡及侵袭能力变化,蛋白质印迹法检测BAX、Bcl-2、MMP-2、N-cadherin及E-cadherin的表达。

结果  CAL-27细胞中miR-222-3p的表达水平显著高于hNOK细胞(P<0.05)。与inhibitor NC组和NC组相比,miR-222-3p inhibitor组CAL-27细胞的凋亡率显著升高,增殖、侵袭能力显著降低(P<0.05), 且Bcl-2、MMP-2和N-cadherin蛋白表达水平显著降低,BAX和E-cadherin蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。

结论  miR-222-3p在CAL-27细胞中高表达,下调miR-222-3p可抑制CAL-27细胞的增殖和侵袭能力,并促进细胞凋亡。

全文|Full-text

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一,易发生头部或颈部淋巴结转移,严重影响患者预后和生存[1-2]。因此探讨OSCC发生发展的分子机制对寻找OSCC治疗靶点以及改善OSCC患者预后具有重要意义。微小RNA(miRNA,miR)是一类内源性单链非编码小分子RNA,可通过调节其下游靶基因的表达参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学过程,与多种肿瘤的发生发展、预后密切相关[3-4]。近年研究显示,miR-222-3p在宫颈癌[5]、非小细胞肺癌[6]及甲状腺癌[7]等多种恶性肿瘤组织中异常表达,并与患者预后密切相关。已有证据显示,miR-222-3p在OSCC患者外周血中高表达,且与TNM分期和淋巴结转移及生存期密切相关。但miR-222-3p在OSCC中的作用机制尚未明确,本研究通过分析miR-222-3p对人OSCC CAL-27细胞增殖、凋亡及侵袭的影响,初步探讨其对OSCC生物学行为的影响,为OSCC的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

人OSCC CAL-27细胞株及人正常口腔角质细胞株(hNOK)均购自北京北纳创联生物技术研究院。RPMI-1640培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、Trizol试剂、脂质体lipofectamine 2000 购自美国Invitrogen公司;反转录试剂盒和SYBR Green荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司;甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)试剂盒(M-0283)购自美国Sigma公司;BAX(ab32503)、Bcl-2(ab32124)、MMP-2(ab92536)、 N-cadherin(ab76011)、E-cadherin(ab40772)及β-actin(ab8226)抗体购自英国Abcam公司。

1.2 细胞培养及转染

CAL-27和hNOK细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的RPMI-1640培养基,置于37℃、5%CO2的培养箱中。实验分为对照组(NC组)、inhibitor NC组和miR-222-3p inhibitor组。将对数生长期的CAL-27细胞接种到96孔板(1×104/孔)中,待细胞融合度达到70%左右按照liporfectamine 2000转染试剂说明书分别将miR-222-3p inhibitor和阴性对照质粒(inhibitor NC)转染至细胞,转染48 h后进行后续实验。

1.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

采用RNA提取试剂盒提取各组细胞的总RNA,并逆转录合成cDNA,然后使用qRT-PCR仪(美国ABI)进行qRT-PCR检测。引物序列:miR-222-3p上游5'-AGCTACATCT GGCTACTGGGT-3',下游5'-GCGAGCACAGAA TTAATACGA C-3';U6上游5'-CTCGCT TCGGCAGCACA-3',下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。反应条件:95 ℃预变性15 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,40个循环。以U6为内参,采用2-△△Ct法计算细胞中miR-222-3p的相对表达水平。

1.4 MTT法检测细胞增殖能力

将CAL-27细胞接种至96孔板中,分别培养24,48,72和96 h后,每孔加入20 μL MTT试剂,继续培养4 h,弃上清加入150 μL DMSO振荡充分溶解,于酶标仪上检测波长在570 nm处测吸光值(OD),检测各组细胞的增殖情况。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

利用Annexin-V和碘化丙碇(PI)凋亡检测试剂盒(美国Sigma-Aldrich)检测细胞凋亡。将转染48 h的CAL-27细胞消化后,重悬于结合缓冲液中,混匀后加入5 μL Annexin V(FITC),避光染色10 min后加入50 mg/L PI染色室温避光反应5 min,采用流式细胞仪(美国Becton Dickinson)检测细胞凋亡情况。

1.6 Transwell检测细胞侵袭

将转染后的细胞悬浮液100 μL加入小室的上室中,将600 μL含有10%FBS的PRMI-1640培养基或100 μL稀释后的Matrigel基质胶均匀加到下室中,37℃、5%CO2培养箱培养24 h后,用棉签擦去上室细胞,4%多聚甲醛固定迁移到下室的细胞,0.1%结晶紫染色,洗净晾干后,倒置于显微镜下随机选取5个视野进行计数。实验重复3次。

1.7 蛋白质印迹法检测蛋白表达水平

采用细胞总蛋白提取试剂盒提取总蛋白,BCA法测定蛋白质浓度后进行SDS-PAGE电泳,转膜后用含5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入BAX、Bcl-2、MMP-2、 N-cadherin、E-cadherin及β-actin(1 : 1 000)一抗,4℃孵育过夜,洗膜后,加入HRP标记的羊抗兔或鼠的二抗IgG(1 ∶ 2 000)。室温孵育2 h后,暗室中用ECL发光,并采用软件Image J进行图像分析。以β-actin为内参,计算目的蛋白的相对表达量。

1.8 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。本研究各项实验均重复3次,计量资料用表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验;计数资料采用χ2检验。P<0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-222-3p在CAL-27细胞中的表达

CAL-27细胞中miR-222-3p的表达水平显著高于hNOK细胞(4.63±0.35 vs. 1.01±0.21, P<0.001)。

2.2 各组细胞miR-222-3p的表达

qRT-PCR检测结果显示,miR-222-3p inhibitor组miR-222-3p的相对表达量显著低于inhibitor NC组和NC组(P<0.05);inhibitor NC组和NC组间miR-222-3p的表达水平差异无统计学意义(P>0.05),见图1。

  • 图1 各组细胞miR-222-3p的表达(n=3)
    Figure1.Expression of miR-222-3p in each group (n=3)
    注:与inhibitor NC组和NC组相比,*P<0.05

2.3 miR-222-3p对CAL-27细胞增殖能力的影响

MTT实验结果显示,miR-222-3p inhibitor组CAL-27细胞在48,72,96 h处的增殖能力显著低于inhibitor NC组和NC组(P<0.05),而inhibitor NC组和NC组间差异无统计学意义(P>0.05),见图2。

  • 图2 miR-222-3p对CAL-27细胞
    Figure2.增殖能力的影响(n=3)
    Figure 2. Effects of miR-222-3p on proliferation of CAL-27 cells (n=3)

2.4 miR-222-3p对CAL-27细胞凋亡的影响

Annexin-V/PI双染结果显示,miR-222-3p inhibitor组的细胞凋亡率显著高于inhibitor NC组和NC组(P<0.05),而inhibitor NC组和NC组间差异无统计学意义(P>0.05),见图3-A。进一步对凋亡下游标志蛋白进行检测,结果显示,与inhibitor NC组和NC组相比,miR-222-3p inhibitor组BAX蛋白表达水平显著升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05);inhibitor NC组和NC组细胞中BAX和Bcl-2的蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),见图3-B。

  • 图3 miR-222-3p对CAL-27细胞凋亡的影响(n=3)
    Figure3.Effect of miR-222-3p on apoptosis of CAL-27 cells (n=3)
    注:A:流式细胞术检测细胞凋亡;Q1-UL:机械错误;Q1-UR:晚期凋亡或坏死细胞;Q1-LL:活细胞;Q1-LR:早期凋亡细胞;B:蛋白质印迹法检测BAX和Bcl-2蛋白水平;与inhibitor NC组和NC组相比,*P<0.05

2.5 miR-222-3p对CAL-27细胞侵袭的影响

Transwell检测结果显示,miR-222-3p inhibitor组细胞侵袭数量均显著低于inhibitor NC组和NC组(P<0.05),见图4-A。蛋白质印迹法分析显示,与inhibitor NC组和NC组相比,miR-222-3p inhibitor组MMP-2和N-cadherin蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),E-cadherin表达水平显著升高(P<0.05),inhibitor NC组和NC组细胞中MMP-2、N-cadherin和E-cadherin的蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),见图4-B。

  • 图4 miR-222-3p对CAL-27细胞侵袭的影响(n=3)
    Figure4.Influence of miR-222-3p on CAL-27 cell invasion (n=3)
    注:A:Transwell检测细胞侵袭;B:蛋白质印迹法检测MMP-2、N-cadherin和E-cadherin蛋白水平;与inhibitor NC组和NC组相比,*P<0.05

3 讨论

OSCC是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,易发生区域淋巴结转移,严重威胁人类的健康[8],因此寻找新的分子靶点对OSCC的诊断、治疗及预后评估具有临床意义。miRNA现已成为生物医学领域的研究热点,其通过调控下游目标基因的表达,在细胞增殖、分化及免疫调节等多种生理病理学过程中发挥着重要作用[9]。目前研究发现多种miRNA在肿瘤中异常表达,可作为肿瘤早期诊断、预后评估及靶向治疗的靶点[10]。因此分析OSCC相关miRNA的作用及机制,有利于探寻新的治疗靶点。

miR-222-3p是一类重要的miRNA,在多种恶性肿瘤中高表达,与肿瘤的发生发展密切相关[11-12]。miR-222-3p在甲状腺癌中高表达,其可通过靶向SLC4A4促进甲状腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移,有望成为甲状腺癌患者的分子治疗靶点[13]。miR-222-3p在宫颈癌患者血清和宫颈癌细胞系SiHa中表达上调,其通过抑制SOCS5增强宫颈癌细胞SiHa增殖、迁移和侵袭能力,可能参与宫颈癌的发病[14]。Sun等研究发现miR-222-3p在肝细胞癌组织和细胞系中显著上调,乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,HBV)感染后miR-222-3p进一步升高;miR-222-3p通过下调THBS1调控HBV (-) HepG2细胞、HBV (+) HepG2.2.15细胞、Huh7-V细胞、Huh7-HBV细胞的增殖和凋亡,说明miR-222-3p可能是肝细胞癌和HBV相关肝细胞癌潜在的诊断和治疗靶点[15]。此外,许云等研究发现OSCC组织中miRNA-222表达升高,且与肿瘤直径、TNM分期、分化程度、淋巴结转移有关,可作为诊断和病情判断的生物学指标[16]。miR-222-3p在OSCC患者外周血中高表达,且与pTNM分期和淋巴结转移及生存期密切相关[17]。然而,miR-222-3p在OSCC中的作用尚未明确。

为探讨miR-222-3p在OSCC中的作用,本研究检测了miR-222-3p在CAL-27细胞中的表达,结果发现miR-222-3p在CAL-27细胞株中高表达。为进一步探讨miR-222-3p在OSCC进展中的功能,通过CAL-27细胞中转染miR-222-3p inhibitor,结果发现,转染miR-222-3p inhibitor后,CAL-27细胞的凋亡率显著升高,增殖、侵袭能力显著降低。此外,通过分析凋亡及侵袭相关蛋白表达发现,下调miR-222-3p表达后,BAX、E-cadherin蛋白表达水平明显升高,Bcl-2、MMP-2和N-cadherin蛋白表达水平明显降低,说明下调miR-222-3p表达能够抑制CAL-27细胞的增殖和侵袭,促进细胞凋亡,与SCC-15和Tca-83细胞中的研究结果一致[18],说明在不同OSCC细胞系中,miR-222-3p的作用基本一致。但miR-222-3p是如何调控OSCC细胞的增殖、侵袭和凋亡及其在不同OSCC细胞系中的作用机制还需更深入的探讨。

综上所述,miR-222-3p在CAL-27细胞中高表达,下调miR-222-3p表达能抑制CAL-27细胞的增殖和侵袭能力,并促进细胞凋亡,可作为OSCC的生物治疗的潜在靶标之一。

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