口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一，易发生头部或颈部淋巴结转移，严重影响患者预后和生存[1-2]。因此探讨OSCC发生发展的分子机制对寻找OSCC治疗靶点以及改善OSCC患者预后具有重要意义。微小RNA（miRNA，miR）是一类内源性单链非编码小分子RNA，可通过调节其下游靶基因的表达参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学过程，与多种肿瘤的发生发展、预后密切相关[3-4]。近年研究显示，miR-222-3p在宫颈癌[5]、非小细胞肺癌[6]及甲状腺癌[7]等多种恶性肿瘤组织中异常表达，并与患者预后密切相关。已有证据显示，miR-222-3p在OSCC患者外周血中高表达，且与TNM分期和淋巴结转移及生存期密切相关。但miR-222-3p在OSCC中的作用机制尚未明确，本研究通过分析miR-222-3p对人OSCC CAL-27细胞增殖、凋亡及侵袭的影响，初步探讨其对OSCC生物学行为的影响，为OSCC的治疗提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 细胞及主要试剂
人OSCC CAL-27细胞株及人正常口腔角质细胞株（hNOK）均购自北京北纳创联生物技术研究院。RPMI-1640培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、Trizol试剂、脂质体lipofectamine 2000 购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒和SYBR Green荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂盒（M-0283）购自美国Sigma公司；BAX（ab32503）、Bcl-2（ab32124）、MMP-2（ab92536）、 N-cadherin（ab76011）、E-cadherin（ab40772）及β-actin（ab8226）抗体购自英国Abcam公司。
1.2 细胞培养及转染
CAL-27和hNOK细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的RPMI-1640培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中。实验分为对照组（NC组）、inhibitor NC组和miR-222-3p inhibitor组。将对数生长期的CAL-27细胞接种到96孔板（1×104/孔）中，待细胞融合度达到70%左右按照liporfectamine 2000转染试剂说明书分别将miR-222-3p inhibitor和阴性对照质粒（inhibitor NC）转染至细胞，转染48 h后进行后续实验。
1.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
采用RNA提取试剂盒提取各组细胞的总RNA，并逆转录合成cDNA，然后使用qRT-PCR仪（美国ABI）进行qRT-PCR检测。引物序列：miR-222-3p上游5'-AGCTACATCT GGCTACTGGGT-3'，下游5'-GCGAGCACAGAA TTAATACGA C-3'；U6上游5'-CTCGCT TCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。反应条件：95 ℃预变性15 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40个循环。以U6为内参，采用2-△△Ct法计算细胞中miR-222-3p的相对表达水平。
1.4 MTT法检测细胞增殖能力
将CAL-27细胞接种至96孔板中，分别培养24，48，72和96 h后，每孔加入20 μL MTT试剂，继续培养4 h，弃上清加入150 μL DMSO振荡充分溶解，于酶标仪上检测波长在570 nm处测吸光值（OD），检测各组细胞的增殖情况。
1.5 流式细胞术检测细胞凋亡
利用Annexin-V和碘化丙碇（PI）凋亡检测试剂盒（美国Sigma-Aldrich）检测细胞凋亡。将转染48 h的CAL-27细胞消化后，重悬于结合缓冲液中，混匀后加入5 μL Annexin V（FITC），避光染色10 min后加入50 mg/L PI染色室温避光反应5 min，采用流式细胞仪（美国Becton Dickinson）检测细胞凋亡情况。
1.6 Transwell检测细胞侵袭
将转染后的细胞悬浮液100 μL加入小室的上室中，将600 μL含有10%FBS的PRMI-1640培养基或100 μL稀释后的Matrigel基质胶均匀加到下室中，37℃、5%CO2培养箱培养24 h后，用棉签擦去上室细胞，4%多聚甲醛固定迁移到下室的细胞，0.1%结晶紫染色，洗净晾干后，倒置于显微镜下随机选取5个视野进行计数。实验重复3次。
1.7 蛋白质印迹法检测蛋白表达水平
采用细胞总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度后进行SDS-PAGE电泳，转膜后用含5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入BAX、Bcl-2、MMP-2、 N-cadherin、E-cadherin及β-actin（1 : 1 000）一抗，4℃孵育过夜，洗膜后，加入HRP标记的羊抗兔或鼠的二抗IgG（1 ∶ 2 000）。室温孵育2 h后，暗室中用ECL发光，并采用软件Image J进行图像分析。以β-actin为内参，计算目的蛋白的相对表达量。
1.8 统计学分析
采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。本研究各项实验均重复3次，计量资料用表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用χ2检验。P＜0.05代表差异有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-222-3p在CAL-27细胞中的表达
CAL-27细胞中miR-222-3p的表达水平显著高于hNOK细胞（4.63±0.35 vs. 1.01±0.21， P＜0.001）。
2.2 各组细胞miR-222-3p的表达
qRT-PCR检测结果显示，miR-222-3p inhibitor组miR-222-3p的相对表达量显著低于inhibitor NC组和NC组（P＜0.05）；inhibitor NC组和NC组间miR-222-3p的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。
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图1 各组细胞miR-222-3p的表达（n=3）
Figure1.Expression of miR-222-3p in each group (n=3)
注：与inhibitor NC组和NC组相比，*P＜0.05
2.3 miR-222-3p对CAL-27细胞增殖能力的影响
MTT实验结果显示，miR-222-3p inhibitor组CAL-27细胞在48，72，96 h处的增殖能力显著低于inhibitor NC组和NC组（P＜0.05），而inhibitor NC组和NC组间差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。
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图2 miR-222-3p对CAL-27细胞
Figure2.增殖能力的影响（n=3）
Figure 2. Effects of miR-222-3p on proliferation of CAL-27 cells (n=3)
2.4 miR-222-3p对CAL-27细胞凋亡的影响
Annexin-V/PI双染结果显示，miR-222-3p inhibitor组的细胞凋亡率显著高于inhibitor NC组和NC组（P＜0.05），而inhibitor NC组和NC组间差异无统计学意义（P＞0.05），见图3-A。进一步对凋亡下游标志蛋白进行检测，结果显示，与inhibitor NC组和NC组相比，miR-222-3p inhibitor组BAX蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；inhibitor NC组和NC组细胞中BAX和Bcl-2的蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），见图3-B。
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图3 miR-222-3p对CAL-27细胞凋亡的影响（n=3）
Figure3.Effect of miR-222-3p on apoptosis of CAL-27 cells (n=3)
注：A：流式细胞术检测细胞凋亡；Q1-UL：机械错误；Q1-UR：晚期凋亡或坏死细胞；Q1-LL：活细胞；Q1-LR：早期凋亡细胞；B：蛋白质印迹法检测BAX和Bcl-2蛋白水平；与inhibitor NC组和NC组相比，*P＜0.05
2.5 miR-222-3p对CAL-27细胞侵袭的影响
Transwell检测结果显示，miR-222-3p inhibitor组细胞侵袭数量均显著低于inhibitor NC组和NC组（P＜0.05），见图4-A。蛋白质印迹法分析显示，与inhibitor NC组和NC组相比，miR-222-3p inhibitor组MMP-2和N-cadherin蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），E-cadherin表达水平显著升高（P＜0.05），inhibitor NC组和NC组细胞中MMP-2、N-cadherin和E-cadherin的蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），见图4-B。
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图4 miR-222-3p对CAL-27细胞侵袭的影响（n=3）
Figure4.Influence of miR-222-3p on CAL-27 cell invasion (n=3)
注：A：Transwell检测细胞侵袭；B：蛋白质印迹法检测MMP-2、N-cadherin和E-cadherin蛋白水平；与inhibitor NC组和NC组相比，*P＜0.05
3 讨论
OSCC是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，易发生区域淋巴结转移，严重威胁人类的健康[8]，因此寻找新的分子靶点对OSCC的诊断、治疗及预后评估具有临床意义。miRNA现已成为生物医学领域的研究热点，其通过调控下游目标基因的表达，在细胞增殖、分化及免疫调节等多种生理病理学过程中发挥着重要作用[9]。目前研究发现多种miRNA在肿瘤中异常表达，可作为肿瘤早期诊断、预后评估及靶向治疗的靶点[10]。因此分析OSCC相关miRNA的作用及机制，有利于探寻新的治疗靶点。
miR-222-3p是一类重要的miRNA，在多种恶性肿瘤中高表达，与肿瘤的发生发展密切相关[11-12]。miR-222-3p在甲状腺癌中高表达，其可通过靶向SLC4A4促进甲状腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，有望成为甲状腺癌患者的分子治疗靶点[13]。miR-222-3p在宫颈癌患者血清和宫颈癌细胞系SiHa中表达上调，其通过抑制SOCS5增强宫颈癌细胞SiHa增殖、迁移和侵袭能力，可能参与宫颈癌的发病[14]。Sun等研究发现miR-222-3p在肝细胞癌组织和细胞系中显著上调，乙型肝炎病毒（hepatitis b virus，HBV）感染后miR-222-3p进一步升高；miR-222-3p通过下调THBS1调控HBV (-) HepG2细胞、HBV (+) HepG2.2.15细胞、Huh7-V细胞、Huh7-HBV细胞的增殖和凋亡，说明miR-222-3p可能是肝细胞癌和HBV相关肝细胞癌潜在的诊断和治疗靶点[15]。此外，许云等研究发现OSCC组织中miRNA-222表达升高，且与肿瘤直径、TNM分期、分化程度、淋巴结转移有关，可作为诊断和病情判断的生物学指标[16]。miR-222-3p在OSCC患者外周血中高表达，且与pTNM分期和淋巴结转移及生存期密切相关[17]。然而，miR-222-3p在OSCC中的作用尚未明确。
为探讨miR-222-3p在OSCC中的作用，本研究检测了miR-222-3p在CAL-27细胞中的表达，结果发现miR-222-3p在CAL-27细胞株中高表达。为进一步探讨miR-222-3p在OSCC进展中的功能，通过CAL-27细胞中转染miR-222-3p inhibitor，结果发现，转染miR-222-3p inhibitor后，CAL-27细胞的凋亡率显著升高，增殖、侵袭能力显著降低。此外，通过分析凋亡及侵袭相关蛋白表达发现，下调miR-222-3p表达后，BAX、E-cadherin蛋白表达水平明显升高，Bcl-2、MMP-2和N-cadherin蛋白表达水平明显降低，说明下调miR-222-3p表达能够抑制CAL-27细胞的增殖和侵袭，促进细胞凋亡，与SCC-15和Tca-83细胞中的研究结果一致[18]，说明在不同OSCC细胞系中，miR-222-3p的作用基本一致。但miR-222-3p是如何调控OSCC细胞的增殖、侵袭和凋亡及其在不同OSCC细胞系中的作用机制还需更深入的探讨。
综上所述，miR-222-3p在CAL-27细胞中高表达，下调miR-222-3p表达能抑制CAL-27细胞的增殖和侵袭能力，并促进细胞凋亡，可作为OSCC的生物治疗的潜在靶标之一。
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