目的  探讨Nrf2/GPX4信号通路在鸢尾素减轻脂多糖（LPS）诱导的大鼠急性肺损伤中的作用。

方法  将72只健康雄性SD大鼠随机分为对照组（C组）、急性肺损伤组（ALI组）、鸢尾素组（Ir组）、鸢尾素+Nrf2抑制剂组（Ir+ML385组）。各组于模型制备后24 h收集支气管肺泡灌洗液（BALF），测定BALF中蛋白浓度，采用ELISA法检测BALF中IL-6、TNF-α含量；HE染色观察肺组织病理学结果并评分，计算肺组织湿/干重比；比色法检测肺组织中Fe²⁺、MDA、GSH含量；Western blot测定肺组织中GPX4、ACSL4及胞核Nrf2的表达。

结果  与C组比较，ALI组中BALF蛋白浓度、IL-6、TNF-α含量、肺组织病理损伤评分、湿/干重比、Fe²⁺、MDA含量均增加，GSH含量降低，GPX4表达降低，ACSL4、胞核Nrf2表达增加（P＜0.05）；与ALI组比较，Ir组中BALF蛋白浓度、IL-6、TNF-α含量、肺组织病理损伤评分、湿/干重比、Fe²⁺、MDA含量均降低，GSH含量增加，GPX4、胞核Nrf2表达增加，ACSL4表达降低（P＜0.05）；与Ir组比较，Ir+ML385组中BALF蛋白、IL-6、TNF-α含量、肺组织病理损伤评分、湿/干重比、Fe²⁺、MDA含量均增加，GSH含量降低，GPX4、胞核Nrf2表达降低，ACSL4表达增加（P＜0.05）。

结论  Nrf2/GPX4信号通路参与了鸢尾素减轻LPS诱导的大鼠急性肺损伤的过程，其与抑制铁死亡有关。

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是由各种直接或间接致伤因素所致，以肺内弥漫性炎性细胞浸润、肺血液循环障碍和肺毛细血管通透性增加为特征的临床综合征，可进一步发展为急性呼吸窘迫综合征，病死率较高[1]。铁死亡是近年来发现的一种铁依赖性的脂质过氧化驱动的非凋亡性细胞死亡方式。铁催化的脂质自由基形成、谷胱甘肽（GSH）损耗以及脂质修复酶谷胱甘肽过氧化物酶4 （glutathione peroxidase 4，GPX4）的失活参与构成了铁死亡的生化机制[2-3]。近年来，铁死亡被证实在脂多糖（LPS）诱导的ALI、肠缺血再灌注损伤诱导的ALI、油酸诱导的ALI和急性辐射诱导的ALI等多种ALI疾病中发挥作用[4]。核因子E2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）和GPX4作为铁死亡过程中的关键调节因子，参与了脓毒症相关ALI的发生发展。Nrf2/ARE信号通路激活后，可以诱导一系列细胞保护基因如谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）基因的表达，GPX4失活可导致脂质过氧化物积累和铁死亡，在铁死亡过程中发挥负调控作用[5-7]。前期研究结果表明，鸢尾素预处理可减轻脓毒症ALI，但其具体作用机制尚未明确[2]。本研究拟探讨Nrf2/GPX4信号通路在鸢尾素减轻LPS诱导的大鼠急性肺损伤中的作用及其与铁死亡的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

SPF级健康成年雄性SD大鼠72只，6~8周龄，体重225~250 g，由武汉大学中南医院动物中心提供。采用随机数字表法将其分为对照组（C组）、急性肺损伤组（ALI组）、鸢尾素组（Ir组）、鸢尾素+Nrf2抑制剂组（Ir+ML385组）四组。本实验程序经武汉大学动物伦理委员会批准（伦理编号：ZN2021185）。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备与分组处理

采用静脉注射LPS（Escherichia coli O111: B4，Sigma-Aldrich，美国）8 mg/kg制备ALI模型[2]。C组注射等量生理盐水；Ir组于LPS注射前30 min静脉注射鸢尾素（Phoenix Pharmaceuticals，德国）1 μg/kg；Ir+ML385组于LPS注射前60 min腹腔注射Nrf2抑制剂ML385（Sigma-Aldrich，美国）30 mg/kg，于LPS注射前30 min静脉注射鸢尾素[8-9]。

1.2.2 肺泡灌洗液蛋白、IL-6、TNF-α含量测定

模型制备完成24 h后，腹腔注射戊巴比妥钠80 mg/kg麻醉、处死大鼠。使用无菌磷酸盐缓冲液灌洗肺，收集支气管肺泡灌洗液（BALF），离心后取上清液，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司，中国）测定蛋白浓度。采用酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒测定IL-6、TNF-α含量。

1.2.3 肺组织病理学观察

模型制备结束后随机选取6只大鼠，取左肺下叶组织，4％多聚甲醛液固定24 h，常规石蜡包埋、切片，厚约5 μm，HE染色后光镜下（×200）观察肺组织病理学结果。肺组织病理学损伤评分由3名研究人员独立进行，综合血管充血、出血、细胞浸润聚集、肺泡壁增厚四方面将肺损伤程度分为5级：0=无损伤、1=轻度损伤、2=中度损伤、3=重度损伤、4=极重度损伤[6]。每张切片随机选取10个视野进行评分，取其平均值。

1.2.4 肺组织湿/干重比测定

选取6只大鼠，取左肺中、下叶肺组织，用滤纸吸干肺组织表面的血液和水分后置于干燥洁净的玻璃试管中称湿重，随后置烤箱（80℃，72 h）中烤至恒重并称干重，计算肺组织湿/干重比。

1.2.5 肺组织Fe2+、MDA、GSH含量测定

取50 mg肺组织，加入磷酸盐缓冲液进行匀浆，4℃10 000 g离心10 min后取上清，采用Fe²⁺检测试剂盒（Sigma-Aldrich，美国）、MDA检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司，中国）、GSH检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司，中国）测定上清液中Fe²⁺、MDA、GSH的含量。

1.2.6 免疫印迹试验检测肺组织中GPX4、ACSL4及胞核Nrf2的表达

选取6只大鼠，取左肺下叶组织加入组织裂解液充分裂解，4℃12 000 g离心10 min后取上清液200 μL，分为4份。各取2份上清液，采用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（Thermo，美国）分别提取胞核蛋白和胞浆蛋白。50 μg蛋白样本经SDS-PAGE电泳后，转膜于PDVF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h。依次用兔单克隆抗体GPX4（1 ∶ 1 000，Abcam，美国）、兔单克隆抗体ACSL4（1 ∶ 1 000，Abcam，美国）、兔单克隆抗体Nrf2（1 ∶ 1 000，Abcam，美国）、兔单克隆抗体H2A（1 ∶ 1 000，Abcam，美国）和兔多克隆抗体GAPDH（1 ∶ 1 000，Abcam，美国）于4℃下孵育过夜。取膜用TBST溶液漂洗3次后加入羊抗兔二抗（1 ∶ 5 000，Abcam，美国），于室温中孵育2 h。TBST漂洗3次后，加入新鲜配制的ECL显色液，于生物分子成像仪中成像。采用AlphaEaseFC软件分析成像结果，以目的条带灰度值与内参条带灰度值的比值反映肺组织GPX4、ACSL4、胞核Nrf2蛋白表达水平。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件对实验结果进行分析，正态分布的计量资料以x ± s表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠BALF蛋白、IL-6、TNF-α含量比较

与C组比较，ALI组BALF蛋白、IL-6、TNF-α含量增加（P＜0.05）；与ALI组比较，Ir组BALF蛋白、IL-6、TNF-α含量降低（P＜0.05）；与Ir组比较，Ir+ML385组BALF蛋白、IL-6、TNF-α含量增加（P＜0.05）（图1）。

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  图1 四组大鼠BALF蛋白、IL- 6、TNF-α浓度比较（n=6）

  Figure1.Comparison of the protein contents in BALF and the IL-6 and TNF-α contents among four groups（n=6）

  注：与C组比较，*P<0.05；与ALI组比较，#P<0.05；与Ir组比较，&P<0.05

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2.2 大鼠肺组织病理学变化

光镜下，C组肺泡结构完整，肺泡间隔均匀一致，肺泡腔清晰，无炎性细胞浸润；与C组比较，ALI组肺间质内可见大量炎症细胞浸润，肺泡壁增厚、水肿，可见大量红细胞，病理学损伤评分增加（P＜0.05）；与ALI组比较，Ir组肺泡结构存在，肺泡腔及间质内红细胞和炎症细胞浸润明显减少，病理学损伤评分降低（P＜0.05）；与Ir组比较，Ir+ML385组肺间质内炎症细胞浸润明显增多，肺泡壁增厚、水肿，可见大量红细胞浸润，病理学损伤评分增加（P＜0.05）（图2、图3）。

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  图2 四组大鼠肺组织HE染色（×200）

  Figure2.HE staining of lung tissue sections of rats among four groups (×200)

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  图3 四组大鼠肺组织病理学损伤评分比较（n=6）

  Figure3.Comparison of pathological injury score of lung tissues among four groups（n=6）

  注：与C组比较，*P<0.05；与ALI组比较，#P<0.05；与Ir组比较，&P<0.05

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2.3 大鼠肺组织湿/干重比的比较

与C组比较，ALI组肺组织湿/干重比增加（P＜0.05）；与ALI组比较，Ir组肺组织湿/干重比降低（P＜0.05）；与Ir组比较，Ir+ML385组肺组织湿/干重比增加（P＜0.05）（图4）。

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  图4 四组大鼠肺组织湿/干重比比较（n=6）

  Figure4.Comparison of wet/dry weight ratio of lung tissues among four groups（n=6）

  注：与C组比较，*P<0.05；与ALI组比较，#P<0.05；与Ir组比较，&P<0.05

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^{2.4 大鼠肺组织Fe2+、MDA、GSH含量比较}

与C组比较，ALI组肺组织Fe²⁺、MDA含量增加，GSH含量降低（P＜0.05）；与ALI组比较，Ir组肺组织Fe²⁺、MDA含量降低，GSH含量增加（P＜0.05）；与Ir组比较，Ir+ML385组肺组织Fe²⁺、MDA含量增加，GSH含量降低（P＜0.05）（图5）。

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  图5 四组大鼠肺组织Fe2+、MDA、GSH含量比较（n=6）

  Figure5.Comparison of the contents of Fe2+, MDA and GSH in lung tissues among four groups（n=6）

  注：与C组比较，*P<0.05；与ALI组比较，#P<0.05；与Ir组比较，&P<0.05

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2.5 大鼠肺组织中GPX4、ACSL4、胞核Nrf2的蛋白表达量的比较

与C组比较，ALI组肺组织GPX4表达降低，ACSL4及胞核Nrf2表达增加（P＜0.05）；与ALI组比较，Ir组肺组织GPX4及胞核Nrf2表达增加，ACSL4表达降低（P＜0.05）；与Ir组比较，Ir+ML385组肺组织ACSL4表达增加，GPX4及胞核Nrf2表达降低（P＜0.05）（图6）。

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  图6 四组大鼠肺组织GPX4、ACSL4、胞核Nrf2的蛋白表达比较（n=6）

  Figure6.Comparison of the protein levels of GPX4, ACSL4 and nuclear Nrf2 level in lung tissue among the four groups（n=6）

  注：与C组比较，*P<0.05；与ALI组比较，#P<0.05；与Ir组比较，&P<0.05

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2.6 大鼠急性肺损伤通路

大鼠静脉注射LPS后肺组织核蛋白Nrf2表达增加，可能与释放的内毒素激活体内氧化应激系统，促进Nrf2与Keap1解离并转位于细胞核有关。预先给予鸢尾素处理后，大鼠肺组织中GPX4以及细胞核中Nrf2的表达进一步增加，肺组织病理损伤减轻，Fe²⁺、MDA以及ACSL4水平降低，提示鸢尾素通过激活Nrf2转位入核，促进多种抗氧化反应元件（ARE）基因的转录，通过Nrf2/GPX4信号轴，恢复抗氧化酶GPX4水平，从而发挥抗氧化损伤的作用（图7）。

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  图7 鸢尾素调控Nrf2/GPX4信号减轻脂多糖诱导大鼠急性肺损伤通路示意图

  Figure7.Hypothetical schema for irisin regulating Nrf2/GPX4 signaling pathway to allevi-ate LPS-induced acute lung injury

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3 讨论

本研究制备的大鼠急性肺损伤模型结果表明，相较于C组，ALI组大鼠在LPS注射后BALF中蛋白、IL-6和TNF-α蛋白含量均增加，结合肺组织病理学结果，提示急性肺损伤模型制备成功。此外，与ALI组比较，Ir组中BALF蛋白、IL-6、TNF-α含量降低，肺组织湿/干重比下降、病理学损伤减轻，提示鸢尾素可减轻LPS诱导的大鼠急性肺损伤。

铁死亡是一种铁依赖的非凋亡形式的细胞死亡方式，在形态学、遗传学、代谢和分子生物学等方面均不同于凋亡、自噬和坏死，其主要特征是脂质过氧化物和活性氧堆积[3]。铁死亡其机制主要表现为：膜脂过氧化、细胞亚铁聚集和抗氧化防御的丧失。抗氧化体系（谷胱甘肽系统）的调控核心酶GPX4利用谷胱甘肽GSH为底物，将膜磷脂氢过氧化物还原为无害的脂醇，减少脂质活性氧（ROS）的生成。正常情况下，半胱氨酸作为GSH合成的限速底物，其摄入通过细胞膜xCT系统/胱氨酸/谷氨酸转运体完成。xCT系统特有的亚基SLC7A11介导半胱氨酸从胞膜外转运至胞质，在细胞内合成GSH，并维持GPX4的抗氧化活性，从而提高细胞的抗氧化应激能力。在LPS诱导的肺损伤中出现细胞亚铁和脂质过氧化的积累，线粒体功能障碍，以及抗氧化系统GPX4和GSH的减少。铁死亡还与脂质代谢密切相关。抑制GPX4 会造成大量多不饱和脂肪酸氧化和脂肪酸自由基产生，从而导致细胞铁死亡[10-11]。ACSL4和人溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3通过将多不饱和脂肪酸合并到细胞磷脂中，在促进铁死亡中发挥关键作用[12-14]。铁含量、脂质过氧化物水平以及铁死亡相关蛋白（ACSL4和GPX4）的表达是评估铁死亡的常用指标。

本研究发现，急性肺损伤时肺组织中Fe²⁺、MDA水平升高，GSH含量和GPX4表达降低、ACSL4表达增加，表明铁死亡参与了急性肺损伤的过程。经鸢尾素预处理后，肺组织中Fe²⁺、MDA水平降低，GSH含量和GPX4表达增加，ACSL4表达降低，提示鸢尾素减轻急性肺损伤的机制与抑制铁死亡有关。

核转录因子Nrf2是抗氧化反应的主要调节因子，能被诱导并参与细胞内铁代谢和铁浓度的调节，保护细胞免受氧化损伤以及铁死亡[15-16]。在生理条件下，Nrf2与Keap1结合并被Keap1-Cul3-E3泛素连接酶复合物泛素化而降解。在应激条件下，Nrf2与Keap1分离并激活，转位入细胞核，上调多种抗氧化基因如GPX4、GSH等的表达，从而提高细胞的抗氧化应激能力[17]。GPX4是哺乳动物中修复脂质氧化损伤的硒蛋白，作为Nrf2转录途径中的重要蛋白，GPX4也是细胞铁死亡的重要抑制因子[18]。敲除GPX4或使用GPX4抑制剂RSL3可促进脂质过氧化和胞内活性氧堆积，从而诱导铁死亡[19-20]。

本研究参照文献选择Nrf2抑制剂ML385的使用剂量[9]，结果表明，抑制Nrf2/GPX4通路活性能抵消鸢尾素预处理产生的肺保护效应以及铁死亡抑制效应，提示Nrf2/GPX4信号通路参与了鸢尾素减轻LPS诱导的大鼠急性肺损伤过程，与抑制铁死亡有关。

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