失血性休克是临床常见的死亡原因之一[1]。失血性休克后，需在短时间内进行复苏，但复苏早期的再灌注损伤易导致患者出现多器官损伤[2]，如肾脏对缺血再灌注十分敏感，容易发生损伤，严重时出现肾功能衰竭[3]。研究显示，静脉复苏对失血性休克伴发的肾脏损伤的治疗效果并不理想，同时，大量快速液体复苏可造成肾脏进一步损伤，因此，减轻因休克复苏后再灌注产生的肾损伤十分关键[4-6]。炎症损伤是造成器官再灌注损伤的主要原因[7-8]。组织器官发生再灌注损伤取决于组织器官内炎性反应的程度与性质，与炎症反应有关的细胞因子主要有肿瘤坏死因子和白细胞介素等[9]。JAK/STAT 通路广泛参与细胞应激、生长、增殖、分化和凋亡等。TNF-α、IL-1β等多种细胞因子都是通过活化JAK/STAT 通路进行信号转导[10-11]。研究表明，JAK2/STAT3 信号通路参与了肾缺血再灌注损伤过程[12]。丙酮酸是机体代谢的重要中间产物和三羧酸循环底物。研究显示丙酮酸盐可以减轻失血性休克动物由于复苏所致的器官缺血再灌注损伤[13]。本团队前期研究中还发现，丙酮酸盐腹腔复苏能够抑制失血性休克大鼠肠组织JAK2/STAT3信号通路，改善肠缺血再灌注损伤。据此，本研究拟探讨丙酮酸盐腹膜透析液腹腔复苏对肾缺血再灌注损伤的保护作用及其可能机制。
1 资料与方法
1.1 研究对象
由湖北省实验动物研究中心提供健康成年雄性SPF级SD大鼠40只，体重为200~250 g。采用随机数字表法随机分为假手术组（Sham组）、静脉复苏组（VR组）、生理盐水腹腔复苏组（NR组）和丙酮酸盐腹腔复苏组（PR组） 4组，每组10只。本实验程序经武汉大学动物实验中心实验动物管理与使用委员会批准（WP2020-08138）。
1.2 主要试剂
2.5%葡萄糖丙酮酸盐腹膜透析液（P-PDS）：丙酮酸根离子40 mmol/L、Na+132 mmol/L、Ca2+1.75 mmol/L、Mg2+0.25 mmol/L、Cl-96 mmol/L、葡萄糖浓度为2.5%，用HCl或NaOH调pH值至5.2。TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所），兔来源一抗p-STAT3（ab30647，英国Abcam公司）、p-JAK2（ab32101，英国Abcam公司），GAPDH一抗（ab37168，英国Abcam公司）、二抗（074-1506，美国KPL公司）。
1.3 模型制备
对大鼠术前禁食12 h、禁水4 h以制备失血性休克模型[14]。1%戊巴比妥钠（1 g/100mL，双蒸水配制）40 mg/kg腹腔注射麻醉后，行颈总动脉和股静脉穿刺置管术（一次性使用静脉留置针24G*19mm/Y，威海洁瑞医用制品有限公司），分别用于监测血压和给药。经右股静脉行全身肝素化（300 U/kg），经左股动脉放血造模：行左股动脉穿刺置管术后经左股动脉放血，于10 min左右使平均动脉压降至（35±5）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），并维持该水平1 h，记录大鼠失血量。Sham组仅行右颈总动脉、左股动脉、右股静脉穿刺及全身肝素化；VR组制备模型1 h后经右股静脉采用微量输液泵回输放出的血液及两倍失血量行静脉复苏；NR组模型1 h后行静脉复苏的同时采用微量输液泵向腹腔输注20 mL生理盐水行腹腔复苏，持续输注30 min；PR组制备模型1 h后行静脉复苏的同时采用微量输液泵向腹腔输注20 mL P-PDS，行腹腔复苏，持续输注30 min。
复苏24 h后，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，麻醉后开腹，暴露下腔静脉，采集血标本，室温静置30 min，4℃，2 500×g 离心10 min，取上清备用，随即放血处死动物，取右侧肾脏，冰生理盐水洗净后于冠状面切为两半，一半肾脏采用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成4 μm厚的切片行HE染色，用普通光学显微镜观察。另一半肾脏放入液氮中冻存1 h后转移至-80 ℃冰箱保存[15]。
1.4 肾组织HE染色与肾小管损伤评分
经4%多聚甲醛固定后的肾组织使用自动脱水机经过程序脱水后石蜡包埋，使用自动切片机横切面4 μm连续切片，放入60 ℃恒温烤箱内烤片，24 h后进行HE染色。使用200倍光学显微镜在室温下对染色封片的肾组织结构与形态、肾小球完整性、炎性细胞浸润情况进行观察并拍照。根据肾小管损伤评分指数（Paller评分）进行评分[16]，随机选取光镜下10个视野，每个视野选取10个肾小管，每出现一个改变则按照以下规则计分：肾小管明显扩张、细胞扁平计1分；刷状缘损伤计1分，脱落计2分；间质水肿计1分；细胞空泡变性计1分；肾小管管腔内有脱落坏死的细胞但未形成管型计1分，形成管型计2分；细胞核固缩计1分；上皮细胞颗粒变性计1分。10个视野分值累加为Paller评分，分值越高表明肾小管损伤越严重。
1.5 检测指标
采用血液分析仪（300-G，美国雅培公司）检测血清血尿素氮（blood urine nitrogen，BUN）和血清肌酐（creatinine，Cr）的浓度，利用酶联免疫吸附法测定肾组织 TNF- α和 IL-1β含量（DR-200Bs酶标仪，中国Diatek公司），肾组织p-STAT3、p-JAK2的表达使用Western blot技术进行检测。
1.6 统计学分析
应用SPSS 25.0软件进行统计学分析，计量资料以均数和标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，多组间的两组比较采用事后两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肾组织形态学变化与肾小管损伤评分
光镜下（200倍）Sham组肾组织切片可见肾单位基本正常，肾间质细胞未见明显水肿，未见明显的炎性细胞浸润，肾小球内细胞排列正常。VR组肾组织切片可见肾单位大体结构存在，但肾小球细胞萎缩，基底膜断裂，结构排列混乱，肾间质内可见大量炎性细胞浸润，大量肾小管坏死细胞团块，有较多炎性细胞团块聚集，毛细血管可见淤血及管型存在，近端肾小管可见明显空泡样结构，管腔扩张，刷状缘脱落，远端小管内可见坏死细胞碎片及其形成的管型，部分肾小管内甚至可见淀粉样物质团块。NR组肾组织切片可见肾单位结构基本存在，与VR组相比，其病理损伤程度减轻，肾小球细胞排列正常，基底膜完整，炎性细胞浸润程度减轻，部分肾小管内有管型，刷状缘脱落，但肾小管细胞明显水肿。与VR组、NR组相比，PR组肾病理损伤程度最轻，肾单位结构基本存在，肾间质内仅可见少量炎性细胞浸润，刷状缘基本存在，毛细血管少量淤血，未见管型形成，但可见肾小管细胞水肿（图1）。四组间在Paller评分上存在显著差异，VR组（55.0±4.8）评分最高，显著高于NR组（32.0±5.4）、PR组（21.4±3.8）与Sham组（9.2±2.9），而Sham组评分最低（图2）。
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图1 各组大鼠肾脏组织光镜下形态学变化（HE x200）
Figure1.The morphological changes of rat kidney tissue under light microscope in each group (HE x200)
注：A为Sham组；B为VR组；C为NR组；D为PR组
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图2 各组大鼠肾损伤评分比较
Figure2.Comparison of rat kidney injury scores in each group
注： *与Sham组比较，P<0.05； #与VR组比较，P<0.05； @与NR组比较，P<0.05
2.2 检测指标的变化
与Sham组相比，其他3组的BUN、Cr浓度，TNF-α、IL-1β含量均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。VR组、NR组和PR组3组间BUN、Cr浓度和TNF-α、IL-1β含量均呈逐渐下降的趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。相较于Sham组，肾组织p-JAK2和p-STAT3蛋白在VR组、NR组和PR组中的表达均显著上调，p-JAK2在PR组表达量低于其他2组，而p-STAT3在VR组、NR组和PR组3组中的表达量呈明显下调趋势（表1）。
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表格1 各组大鼠肾组织检测指标比较
Table1.Comparison of the detection indexes of rat kidney tissue in each group
注： *与Sham组比较，P<0.05； #与VR组比较，P<0.05； @ 与NR组比较，P<0.05
3 讨论
失血性休克复苏可导致全身器官发生缺血再灌注损伤[17]。传统的观念是休克后及早进行静脉液体复苏，恢复有效血容量以阻止休克造成的器官组织损伤进一步发展。而接受常规静脉液体复苏的病人却常常会发生多器官功能衰竭，甚至死亡，其原因通常是渐进的内脏血管收缩、血流灌注不足、全身炎症反应及液体不足等[5]。大量资料表明，失血性休克进行静脉复苏后患者内脏器官的血流并没有恢复，全身炎症反应进一步加重，细胞损伤进一步恶化，导致患者多器官功能障碍死亡[18]。虽然传统的复苏方法能够改善包括血压在内的传统指标，但是对胃肠道及肝肾脾等内脏器官灌注状态的效果有限。
本研究中，PR组Paller评分显著低于VR组和NR组，提示肾小管损伤较小。此外，PR组大鼠血液BUN与Cr的含量也低于其他复苏方式。在肾脏发生缺血再灌注损伤时，TNF-α、IL-1β等炎症因子起到重要作用[19-20]。研究发现抑制TNF-α和IL-1β的水平，可以改善肾缺血再灌注损伤[21-22]。本研究也同样观察到肾缺血再灌注损伤时，TNF-α和IL-1β的水平显著升高，与其他复苏方式相比，采用丙酮酸盐腹膜透析液腹腔复苏显著降低了TNF-α和IL-1β的水平。以上结果表明，丙酮酸盐腹膜透析液腹腔复苏改善肾缺血再灌注损伤，其可能与抑制炎症反应有关。
JAK/STAT通路主要由 JAKs蛋白家族和 STATs蛋白家族组成，JAK是 STAT上游靶点，接受细胞外的细胞因子信号刺激并通过调控基因转录，进而通过JAK/STAT通路广泛参与细胞应激、生长、增殖、分化和凋亡等。沈诚等研究发现JAK/STAT通路在脏器缺血再灌注损伤中起到关键作用[23]。进一步研究发现，在肾缺血再灌注损伤中，JAK2/STAT3信号通路明显上调，其介导的炎症反应加重了肾损伤[24]。Lu等发现敲除STAT3基因后，JAK2/STAT3通路受到抑制，肾组织的炎症及损伤明显减轻[25]。邓江涛等发现丙酮酸盐腹腔复苏能够降低肠损伤过程中JAK2/STAT3的磷酸化水平，抑制JAK/STAT通路的激活[26]。本研究也发现，肾缺血再灌注大鼠的JAK2/STAT3通路明显激活，进一步证实JAK2/STAT3信号通路在上述病理进程中发挥重要作用。采用生理盐水腹腔复苏可下调p-STAT3的表达，而p-JAK2的表达水平与单纯静脉复苏无明显差异，但丙酮酸盐腹腔复苏可明显下调JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平，提示采用丙酮酸盐腹膜透析液腹腔复苏能够更显著地抑制JAK2/STAT3信号通路。JAK2/STAT3信号通路能够介导炎症反应，也能因炎症反应而被进一步激活，本研究后续将进一步研究丙酮酸盐腹膜透析液腹腔复苏与JAK2/STAT3信号通路及炎症反应三者之间更为具体的调控关系。
本研究显示，丙酮酸盐腹膜透析液可减轻肾脏的缺血再灌注损伤，降低炎性反应，抑制p-JAK2/STAT3蛋白表达，改善肾功能。其机制可能与降低炎症反应、抑制JAK2/STAT3信号通路的激活有关。
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