乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，2020年世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）最新发布的全球癌症负担数据表明，全球乳腺癌新发病例高达226万例，超过肺癌成为全球第一大癌[1-2]。2012年我国新诊断乳腺癌占全球的12.2%，死亡病例占全球的9.6%，该数据源于中国国家癌症登记中心，只有13%的中国人口被纳入，可能低估了我国乳腺癌发病率和死亡率[3]。美国癌症协会最新数据显示，乳腺癌发病率以每年0.3%的速度缓慢增长，主要为Luminal 型乳腺癌[4]。
近年来，人们尝试采用各种高通量分子技术探究乳腺癌的内在本质，根据其分子特征进行分类、治疗及预后评估，其中基因表达谱技术的应用最受关注。Perou等于2000年首次通过基因表达谱聚类分析方法，将乳腺癌分为管腔上皮 A 型 （Luminal A）、管腔上皮 B 型 （Luminal B）、HER-2 过表达型、基底样型 （Basal-like） 和正常乳腺样型 （Normal-like） 5种分子类型。此后，研究者开发了很多简化模式如PAM50和SCMGENE等，来增强分子分型的实用性[5-7]。2011年St.Gallen专家组达成共识，采用雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕激素受体（progesterone receptor, PR）、人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2, HER2）、Ki67 四种免疫组化标记来进行乳腺癌分子分型，将乳腺癌分为Luminal A型、Luminal B型、HER-2 过表达型及三阴性乳腺癌 （triple-negative breast cancer，TNBC）[8-9]。之后的临床研究，证实了它们在预后和治疗反应等方面的特异性，受到广泛认可。不同的分子分型在乳腺癌的治疗和预后上存在一定的差异，其中Luminal A型乳腺癌预后最好，Luminal B型次之，Basal-like型乳腺癌预后最差[8-9]。
微小RNA（microRNA, miRNA）是一类长约22个核苷酸组成的非编码单链RNA分子，通过与靶基因mRNA互补结合，从而参与基因表达转录后的调控[10]。有研究表明，miRNA的表达水平与乳腺癌的免疫组化、分子分型、预后及治疗反应密切相关[11]。Shin等发现miR-199a-5p在三阴性乳腺癌组织中表达低于正常乳腺组织[12]。而Bockmeyer等采用聚类分析方法发现，相较于Luminal型乳腺癌，Basal-like型乳腺癌在miR-199a-3p中表达水平明显上调[13]。在临床上，Basal-like型乳腺癌较Luminal型乳腺癌药物反应性和预后差，且易侵袭和转移。为了探讨Luminal型乳腺癌和Basal-like型乳腺癌间是否存在差异miRNAs导致这种差别，本文拟通过生物信息学方法，系统全面获取和分析Luminal 型和Basal-like型乳腺癌之间差异表达的miRNAs，以期能找到在这两类预后相差较大的乳腺癌中最相关的miRNAs。为以后两类分子分型乳腺癌，尤其是Basal-like型乳腺癌的诊断和治疗方面提供依据。
1 资料与方法
1.1 表达谱芯片数据的获取
在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中，以“microRNAs”和“breast cancer”为检索词进行检索，并按照以下纳入与排除标准进行筛选。纳入标准：①miRNAs物种为人类；②数据集中必须同时包含Luminal型和Basal-like型乳腺癌样本；③数据集根据PAM50划分乳腺癌的分子分型。不同数据集、相同基因平台时，取样本量最大最全者。最后共纳入2个数据集GSE81000与GSE40267，分别由芯片平台GPL10656与GPL10850提供注释信息。筛选并下载2个数据集中Luminal型和Basal-like型的乳腺癌miRNAs微阵列数据集，其中GSE81000中Luminal型乳腺癌244例，Basal-like型乳腺癌45例； GSE40267中Luminal型和Basal-like型乳腺癌分别为20例和94例。
1.2 差异表达miRNAs的筛选
利用GEO2R在线分析工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?），分析Luminal型和Basal-like型2组乳腺癌的微阵列数据，以P＜0.05且差异倍数（fold change, FC）的绝对值≥1.5作为差异表达miRNAs的筛选标准。使用Venn diagram webtool（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）筛选两个数据集相交的miRNAs。两个数据集共同的差异miRNAs被视为关键miRNAs。
1.3 差异表达miRNAs的靶基因预测
利用miRNAs靶基因预测数据库mirDIP[14]（http://ophid.utoronto.ca/mirDIP/index.jsp#r）在线预测2组乳腺癌差异表达miRNAs的潜在靶基因，并根据Integrated Score值≥0.9筛选最相关的靶基因。
1.4 实时荧光定量PCR检测差异表达miRNAs
人乳腺癌细胞系MCF-7与MDA-MB-468 来源于ATCC，采用10%胎牛血清的DMEM培养基于37℃恒温孵箱中培养，选择处于对数生长期的细胞进行实验。采用TRIZOL分别提取MCF-7细胞与MDA-MB-468细胞的总RNA。利用反转录试剂盒（ELK Biotechnology）生成cDNA模板，再采用qRT-PCR试剂盒（ELK Biotechnology）检测差异miRNAs的相对表达水平，以U6基因的mRNA作为内参基因。hsa-miR-199a-5p正向引物序列5'-CCCAGTGTTCAGACTACCTGTTC- 3'，反向引物序列5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3'；hsa-miR-199b-5p正向引物序列5'-CCCAGTGT TTAGACTATCTGTTCCT-3'，反向引物序列5'- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC- 3'。PCR扩增条件：预变性95℃3 min；循环段，95℃10s，58℃30s，72℃30s，循环40次。数据采用2-ΔΔCT 法进行分析。
1.5 不同分子分型乳腺癌差异表达miRNAs的生存分析
利用METABRIC数据库（http://www.cbiopor tal.org/study/summary?id=brca_metabric），对Breast cancer miRNA中979例 Luminal型乳腺癌组织样本（其中Luminal A型546例、Luminal B型433例）和203例Basal-like型乳腺癌组织样本，在hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-199b-5p中的差异表达进行生存分析。
1.6 统计分析
通过R语言的Pheatmap包对筛选出来最相关靶基因进行可视化分析。采用SPSS 20.0处理PCR数据，两组间采用独立样本t检验，以P＜0.05具有统计学差异。对METABRIC数据库中筛选样本采用Kaplan-Meier Plotter（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=breast_mirna）进行生存分析，针对所有可能值分组进行Cox回归，将最小P值对应的分界值确定为最佳cut off 值，P＜0.05具有统计学差异。
2 结果
2.1 差异表达miRNAs的获取
采用GEO2R分析工具，根据筛选标准，从数据集GSE81000与GSE40267中共筛选出896 条差异miRNAs，其中人源miRNAs 878条，最终在两个数据集中筛选出35种关键miRNAs，详见图1。相较于Luminal型乳腺癌，有18种miRNAs在Basal-like型患者中表达下调，17种miRNAs表达上调（表1）。
图1 两个数据集差异表达miRNAs韦恩图
Figure 1. Venn diagram of differential expression of miRNAs in two data sets
注：A是下调miRNAs，B是上调miRNAs。
表1 利用GEO2R在线分析工具筛选获得差异表达的关键miRNAs
Table 1. The Key differentially expressed miRNAs were screened by GEO2R online analysis
2.2 差异表达miRNAs的靶基因预测
靶基因预测数据库mirDIP检索并筛选结果显示，35种关键miRNAs的潜在靶基因共4 180个，最相关的靶基因有19个，其中5个靶基因（SLC24A3、MYRF、PODXL、CELSR1、CAPRIN1）由miR-199a-5p与miR-199b-5p共同靶向。使用R语言Pheatmap包进行可视化分析，结果如图2所示。
图2 利用靶基因预测数据库mirDIP预测差异表达miRNAs的最相关靶基因结果
Figure 2. The most relevant target genes of predicted differentially expressed miRNAs by target gene prediction database mirDIP
2.3 实时荧光定量PCR检测差异表达miRNAs
采用qRT-PCR检测人乳腺癌细胞MCF-7（Luminal型）和MDA-MB-468（Basal-like型）细胞中miR-199a-5p与miR-199b-5p的表达水平。与MCF-7细胞相比，MDA-MB-468细胞中miR-199a-5p与miR-199b-5p表达水平均呈下降趋势，但差异不具有统计学意义（P＞0.05）。
2.4 不同分子分型乳腺癌生存分析
利用METABRIC数据库分析546例Luminal A型、433例Luminal B型及203例Basal-like型乳腺癌组织样本中miR-199a-5p和miR-199b-5p的表达水平与患者总体生存率的关系，发现miR-199a-5p与miR-199b-5p表达水平与不同分子分型乳腺癌的预后具有相关性。在Luminal型乳腺癌患者中，miR-199a-5p（P=0.003，cut off值为9.26）与miR-199b-5p（P<0.001，cut off值为9.23）低表达与Luminal A型乳腺癌患者的总生存率降低相关，具有统计学差异，生存分析结果见图3A和图3B。而在Luminal B型乳腺癌中无统计学意义，详见图3C和图3D。尽管在Basal-like型乳腺癌患者中，miR-199a-5p与miR-199b-5p表达与其预后相关性无统计学差异（P＞0.05），但在miR-199a-5p与miR-199b-5p高表达的Basal-like型乳腺癌患者总生存率的整体趋势高于低表达的患者，生存曲线见图3E和图3F。
图3 A、C和E分别表示Luminal A型、Luminal B型和Basal-like型乳腺癌在miR-199a-5P中表达水平与预后生存率的关系；B、D和F分别表示Luminal A型、Luminal B型和Basal-like型乳腺癌在miR-199b-5P中表达水平与预后生存率的关系
Figure 3. Kaplan–Meier overall survival analyses for the miR-199a-5p expressed in the (A) Luminal A, (C) Luminal B, (E) Basal-like breast cancer patients，and the miR-199b-5p expressed in the (B) Luminal A, (D) Luminal B, (F) Basal-like breast cancer patients
3 讨论
乳腺癌在分子水平具有高度异质性，不同分子分型的乳腺癌患者对治疗反应各不相同。4种主要分子分型的乳腺癌患者预后有显著差异，其中Luminal A型乳腺癌预后最好， Basal-like型乳腺癌预后最差。乳腺癌的早期诊断对改善预后至关重要。随着医学技术的发展，分子生物标志物如ER、PR和HER-2，已充分用于诊断和预测肿瘤预后[15]。但这些生物标志物存在一定局限性，不能从外周血直接获取。
miRNA可以调控细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤微环境、侵袭和迁移，在乳腺癌的发生和发展中具有重要作用 [16-17]。再加上miRNA在血液中的稳定性、无创性、特异性和可测量性[18-19]，使其成为乳腺癌诊断、治疗和预后预测理想的生物标志物。不同于以往的小样本研究，本研究整合了来自不同人群的2个miRNA微阵列数据集，通过生物信息学方法分析Luminal 型和Basal-like型乳腺癌之间差异表达的miRNAs。最终筛选出35种差异表达的关键miRNAs，其中18种miRNAs 在Basal-like型乳腺癌相较于Luminal型乳腺癌中表达下调，17种表达上调。靶基因预测获得潜在靶基因共4 180个，最相关的靶基因有19个，与其密切相关的miRNAs是miR-199a-5p和miR-199b-5p。采用qRT-PCR检测其在乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-468细胞表达水平，结果显示与MCF-7细胞相比，MDA-MB-468细胞在miR-199a-5p与miR-199b-5p表达水平均呈下降趋势。目前虽然也有研究表明miR-199a-5p与miR-199b-5p低表达与乳腺癌总生存率显著降低相关，但研究多聚焦TNBC[20-23]。TNBC并不等同于Basal-like乳腺癌，TNBC中还包含20% Non-basal-like乳腺癌[24]。因此，miR-199a-5p和miR-199b-5p表达水平与Basal-like乳腺癌和Luminal乳腺癌预后关系尚未得到评估。本研究侧重于探讨miR-199a-5p和miR-199b-5p的表达水平与Basal-like和Luminal型乳腺癌患者预后的关系。生存分析结果显示，miR-199a-5p与miR-199b-5p低表达与Luminal A型乳腺癌患者的总生存率降低显著相关。而Luminal B型乳腺癌患者预后却与miR-199a-5p与miR-199b-5p表达水平无关。尽管无统计学差异，Basal-like型乳腺癌患者总生存率在miR-199a-5p与miR-199b-5p低表达时亦呈现降低的趋势。有研究表明，miR-199a-5p可靶向Ets-1（E-Twenty-Six-1）的3'-UTR降低β1整合素水平，从而通过FAK/Src/Akt/mTOR信号通路减轻乳腺癌的侵袭[25]。Lin等研究发现miR-199b-5p具有抗血管生成作用，通过直接靶向激活素受体样激酶1（activin receptor-like kinase 1, ALK1），提示miR-199b-5p可能是一个潜在的抗血管生成的乳腺癌治疗靶点[26]。
本研究通过生物信息学分析，确定了35个在Luminal 型和Basal-like型乳腺癌中差异表达的关键miRNAs，可能在乳腺癌的个体化治疗中发挥重要作用。其中，miR-199a-5p、miR-199b-5p与Luminal A型乳腺癌的预后相关，有望成为其治疗的新靶点。相关miRNA在乳腺癌分子分型中的调控机制有待进一步研究。
利益冲突 本研究所有作者均无利益冲突。
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