骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是儿童和青少年最常见的原发性骨恶性肿瘤，全球发病率为4~5/100万[1-3]。目前OS的治疗方案主要为手术切除和新辅助化疗，15%~30%的患者术后出现局部复发，预后较差，复发后长期生存率 ＜20%[4-6]。右美托咪定（Dexmedetomidine，Dex）在外科手术和麻醉过程中被广泛应用于镇静与镇痛治疗。现有研究表明，Dex在肝脏损伤、肺损伤等多种疾病中展现出显著的抗氧化应激、抗炎损伤及抗细胞凋亡保护效应[7- 9]。该保护作用可能与α2-肾上腺素受体（α2-adrenergic receptors，α2-ARs）激活或结合咪唑啉I受体有关[10-11]。细胞外信号调节蛋白激酶1和2（extracellular regulated protein kinases 1 and 2，ERK1/2）作为咪唑啉I受体的重要下游靶标，可通过促进细胞增殖、抑制凋亡及调控血管生成等机制，增强肿瘤恶性表型[12-13]。但ERK1/2的下游信号较为复杂，其致癌作用的机制尚不完全清楚。本研究深入探讨ERK1/2信号通路及其下游效应分子介导Dex促癌作用的具体机制，旨在为OS的临床治疗提供潜在的治疗靶点。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
OS细胞（MG63和143B）和hFOB 1.19（SV40永生化正常成骨细胞系）由中科院上海生命科学研究院细胞资源中心提供；胎牛血清（FBS）、DMEM培养基购自美国HyClone公司；青霉素-链霉素购自美国Invitrogen公司；MTT检测试剂盒及α2-ARs、PKA、ERK1/2、TRIO、PKN2、CKAP5抗体购自上海Abcam公司；细胞凋亡检测试剂盒购自Elabscience公司；ECL试剂盒购自Milllipore公司；Dex、α2-ARs拮抗剂（Atipamezole）、PKA抑制剂（H 89 2HCl）、ERK1/2抑制剂（Ravoxertinib）购自上海Selleck公司；PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）由实验室自备。
1.2 细胞培养
MG63和143B细胞在含有10% FBS、100 U/ mL青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养。hFOB 1.19细胞在含有F12、2.5 mM L-谷氨酰胺（不含酚红）、0.3 mg/mL遗传霉素和10% FBS的DMEM培养基中培养。所有细胞置于37 ℃、5% CO2的恒温细胞培养箱中进行培养。MG63和143B细胞分别用 1 nM、10 nM 、100 nM、1 μM和10 μM的Dex以及0.1 μM、1 μM和10 μM的Atipamezole，浓度为3 μM、30 μM 和300 μM的H 89 2HCl，浓度为1 μM、10 μM和100 μM的Ravoxertinib处理12 h。
1.3 MTT细胞活力检测
将细胞（1×103）接种到96孔板中，每孔加入20 μL 5mg/mL的MTT溶液，轻轻混匀，继续培养4 h。小心吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，水平摇床振荡10 min，充分溶解结晶。酶标仪测量490 nm吸光度。
1.4 生物信息学分析
在GEPIA数据库中搜索与OS中ERK1/2表达呈正相关的基因（P＜0.01和r＞0.2），并输入到DAVID网站（https://david.ncifcrf.gov/）进行GO富集分析。筛选出在细胞增殖、分裂、周期、细胞间黏附、迁移和DNA修复等生物过程中富集的基因。进行交集分析以找到至少与其中三个生物过程有关的基因。筛选出的基因被输入到GEPIA网络中，进一步寻找与OS患者存活率相关的基因。
1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡
按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物公司）说明书对细胞进行染色。使用双激光流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）分析细胞凋亡率，并使用ModFit LT 软件v1.0（美国Verity Software House公司）进行定量分析。
1.6 Transwell侵袭实验
将Transwell小室置于24孔细胞培养板，上室接种100 μL 143B和MG63细胞悬液，密度为8×104个/孔，下室添加600 μL DMEM培养基。培养24 h后，上膜用含0.1%结晶紫溶液的4%多聚甲醛染色。通过在光学显微镜（E200，日本Nikon公司）下对10个随机视野进行计数来量化侵袭细胞。
1.7 细胞集落形成测定
将143B和MG63细胞接种于6孔板，每孔3 000个细胞。在培养箱中静置培养14 d左右，直至清晰观察到细胞集落。4%多聚甲醇固定10 min后，用0.1%结晶紫溶液（Sigma-Aldrich）染色集落5 min。使用ImageJ 1.45软件对集落进行计数。
1.8 RNA提取和qRT-PCR分析
使用Trizol试剂（Takara）提取总RNA，随后用逆转录试剂盒（Sigma-Aldrich, Co. LLC, St. Louis, MO, USA）将RNA逆转录为cDNA。qRT-PCR反应在ABI 7500实时PCR系统（Applied Biosystems, CA, USA）中进行。TRIO正向引物：5'-AAACAGCTACACAGAGATTGGG-3'，反向引物：5'-ACACGTTCATACAGTTCATGGC-3'；PKN2正向引物：5'-TGACCCTCGTTGTTCTACTAGC-3'，反向引物：5'-GTTTCCGATCCTTTGAAGATCCA-3'；CKAP5正向引物：5'-TGTGGAAAGCAAGGTTAA GTGG-3'，反向引物：5'-ACTCTGGGCTCTTTTCA TCCT-3'；GAPDH正向引物：5'-GGAGCGAGAT CCCTCCAAAAT-3'，反向引物：5'-GGCTGTTGTCA TACTTCTCATGG-3'。
1.9 Western blot
在含有蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液（Sigma）中裂解细胞。等量的蛋白质样品（20 μg）通过10% SDS-PAGE进行凝胶电泳，然后进行转模和封闭。使用ERK1/2、TRIO、PKN2、CKAP5抗体（1 ∶ 1 000）进行免疫印迹实验。一抗在4 ℃下孵育过夜。洗膜后使用二抗（1 ∶ 10 000）在室温下孵育1 h，ECL试剂盒进行发光并成像记录。
1.10 转染
特异性靶向TRIO、PKN2 和CKAP5的siRNA和对照siRNA由GenePharma（中国上海）合成。使用Lipofectamine 2000试剂盒（Invitrogen）进行转染，24 h后收集细胞。si-TRIO序列为5'-CCTTCAACCCTTCGGATAATT-3'；si-PKN2序列为5'-TGATATCAAGGATCGAATTAA-3'；si-CKAP5序列为5'-GCTGGCGATTATGCAGATT TA-3'；si-NC序列为5'-GCTAACATAGACGAGT CTAA-3'。
1.11 统计学分析
采用SPSS 23.0软件进行统计分析，GraphPad Prism 9软件作图。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度Dex对OS细胞和hFOB1.19细胞细胞活力的影响
MTT检测发现，1 nM、10 nM 和100 nM的Dex显著提高MG63、143B和hFOB1.19细胞的活力，而10 μM Dex对MG63和hFOB1.19细胞显示出明显毒性作用（图1-A）。25 nM的Dex显著增加MG63和143B细胞活力，并作为后续研究的Dex浓度（图1-B）。随后将不同浓度的Atipamezole、H 89 2HCl和Ravoxertinib单独或与Dex结合添加到MG63和143B细胞中，结果显示，ERK1/2抑制剂不仅可以抑制MG63和143B细胞增殖活力，还能抑制Dex诱导的MG63和143B细胞增殖增加；而Atipamezole和H892HCl仅高浓度表现出增殖活性下降（图1-C）。单独使用高浓度ERK1/2抑制剂治疗也会抑制MG63和143B细胞活力（图1-D）。
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图1 Dex和α2-ARs、PKA、ERK1/2对OS细胞活力影响
Figure1.Effects of Dex, α2-ARs, PKA and ERK1/2 on the viability of OS cells
注：A、B.不同浓度Dex对OS细胞和hFOB1.19细胞细胞活力的影响；C.α2-ARs、PKA和ERK1/2抑制剂联合Dex对OS细胞活力的影响；D.α2-ARs、PKA和ERK1/2抑制剂对OS细胞活力的影响；L、M、H分别指低、中、高浓度；与Control组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与Dex组相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。
2.2 生物信息学分析结果
根据图2-A流程进行生信分析，共筛选出739个与OS中ERK1/2表达呈正相关的基因。随后对筛选出的基因进行GO富集分析，结果显示，这些基因富集于细胞分裂、DNA损伤、细胞周期、细胞间黏附、蛋白质磷酸化、Wnt信号通路和干细胞群维持等癌细胞增殖相关表型（图2-B）。进一步交叉分析，共发现17个至少参与上述三个生物过程的基因，但只有TRIO、PKN2、CKAP5和NEK4基因的表达与OS患者存活率相关（图 2-C）。
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图2 OS中与ERK1/2表达呈正相关基因的生信分析结果
Figure2.Bioinformatics analysis results of genes positively correlated with ERK1/2 expression in OS
注：A.生物信息学分析技术流程图；B.GO富集分析结果；C.基因表达与骨肉瘤患者存活率的生存分析。
2.3 Dex 通过调控ERK1/2上调TRIO、PKN2、CKAP5和 NEK4的表达
GEPIA数据库分析显示，OS样本中TRIO、PKN2、CKAP5、NEK4和ERK2（也称为 MAPK1）表达水平高于正常组织（图3-A），并且与ERK2呈正相关（图3-B）。为确定TRIO、PKN2、CKAP5和NEK4蛋白表达是否受Dex诱导的ERK1/2激活调节，使用ERK1/2抑制剂处理OS细胞。Western blot结果显示，Dex升高了p-ERK1/2、TRIO、PKN2、CKAP5和NEK4蛋白表达水平以及p-ERK1/2和ERK1/2比值，ERK1/2抑制剂可逆转该变化（图3-C）。
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图3 Dex通过ERK1/2对TRIO、PKN2、CKAP5和NEK4表达的影响
Figure3.Effects of Dex on the expressions of TRIO, PKN2, CKAP5 and NEK4 via ERK1/2
注：A.TRIO、PKN2、CKAP5、NEK4和ERK2在骨肉瘤样本中的表达情况；B.TRIO、PKN2、CKAP5、NEK4的表达与ERK2的相关性；C.Western blot结果及定量分析；T.肿瘤组织；N.正常组织；与Control组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与Dex组相比，#P＜0.05，##P ＜0.01，###P ＜0.001。
2.4 TRIO、PKN2和CKAP5介导Dex在OS中的促癌作用
使用靶向TRIO、PKN2和CKAP5的siRNA转染OS细胞。PCR结果显示，Dex可上调MG63和143B细胞TRIO、PKN2和CKAP5 mRNA表达水平，转染后相关mRNA表达水平显著下降（图 4-A）。干扰TRIO、PKN2和CKAP5可抑制Dex诱导的细胞活力增加（图 4-B）。Dex对细胞凋亡的抑制作用在干扰TRIO、PKN2和CKAP5后减弱（图4-C）。Dex诱导的细胞侵袭和集落形成也因干扰TRIO、PKN2和CKAP5而减弱（图5）。
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图4 TRIO、PKN2和CKAP5介导的Dex对细胞活力和凋亡的影响
Figure4.TRIO, PKN2, and CKAP5 mediated effects of Dex on cell viability and apoptosis
注：A.PCR验证转染效果；B.转染对细胞活力的影响；C.转染对细胞凋亡的影响；与Control组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与Dex组相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。
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图5 TRIO、PKN2和CKAP5介导的Dex对细胞侵袭和集落形成的影响
Figure5.TRIO, PKN2, and CKAP5 mediated effects of Dex on invasion and colony formation
注：A、B.转染对细胞侵袭能力的影响与定量分析；C、D.转染对细胞集落形成能力的影响与定量分析；与Control组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与Dex组相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。
3 讨论
本研究发现低浓度Dex可促进OS细胞的生长，而高浓度Dex则抑制其生长，这种作用并非OS细胞特有，在正常成骨细胞hFOB1.19细胞中同样存在，提示Dex对成骨相关细胞的生长调控可能具有普遍性。Dex目前已在手术麻醉期间和手术后广泛使用，其浓度随药物在体内代谢而逐渐降低。但本研究结果显示，低剂量Dex反而促进OS细胞的生长和侵袭，这一结果警示临床OS患者围手术期使用Dex可能存在潜在风险。本研究基于体外细胞实验探究Dex 在OS中的作用及机制，对探寻OS的治疗新策略有着极为重要的意义。
Dex的生理功能均依赖于α2-ARs的激活，而α2-ARs拮抗剂可不同程度逆转其相关效应 [14- 16]。本研究探究了Dex调控OS细胞增殖的信号通路机制，发现ERK1/2抑制剂可有效抑制Dex诱导的OS细胞增殖；而抑制α2-ARs或其下游效应子PKA 对Dex促OS细胞活力增加的抑制作用较弱。此外，在无Dex干预的情况下，中等剂量的ERK1/2抑制剂可直接降低OS细胞活力，而α2-ARs和PKA抑制剂在同等剂量下无此效应。上述结果证实，Dex可通过ERK1/2信号通路影响OS细胞的增殖，进一步验证了ERK1/2通路在OS细胞生长调控中的作用。
ERK1/2通路促进OS的增殖、侵袭的作用已得到广泛证实，但由于ERK1/2下游信号复杂，其介导OS发生发展的具体分子机制仍有待进一步阐明。ERK1/2通路激活后可调控P90RSK、STAT1/3、c-FOS、ER、c-Myc等多个下游效应子，影响肿瘤相关基因的表达，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭等多种生物学过程[17-18]。为明确介导ERK1/2促癌作用的关键效应分子，本研究通过生信分析筛选与ERK1/2表达呈正相关的基因。结合GO富集分析聚焦于癌症增殖、侵袭密切相关的生物学过程，最终筛选出参与至少3个生物学过程的基因进行后续研究。预后分析结果显示，仅TRIO、PKN2、CKAP5和NEK4基因的高表达与肿瘤预后不良有关，提示这4个基因可能是OS预后评估的潜在生物标志物。进一步验证实验表明，ERK1/2抑制剂可显著阻断Dex诱导的TRIO、PKN2、CKAP5和NEK4蛋白水平的升高；Dex可明显上调OS细胞中TRIO、PKN2和CKAP5的mRNA表达，而siRNA介导的基因沉默可消除Dex的这一调控效应，且沉默TRIO、PKN2和CKAP5均可有效抑制Dex对OS细胞生长和侵袭的促进作用。上述结果提示，TRIO、PKN2、CKAP5是Dex通过ERK1/2通路调控OS细胞生物学行为的关键效应分子。
TRIO作为鸟苷二磷酸到鸟苷三磷酸的交换因子，可促进肌动蛋白细胞骨架重组，参与细胞迁移和生长过程，在多种肿瘤进程中发挥促癌作用 [19-20]。PKN2是PKC相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Rho/Rac效应蛋白，参与细胞周期进程、肌动蛋白细胞骨架组装、细胞迁移、细胞黏附、肿瘤细胞侵袭等多个关键生物学过程[21]。CKAP5作为TOG/XMAP215家族的细胞骨架相关蛋白，可保护着丝粒微管免于解聚，对中心体微管组装及定向细胞运动具有重要调控作用[22-23]。但迄今为止，TRIO、PKN2、CKAP5在OS中的表达及功能研究较为匮乏。本研究证实了这3个基因在OS中的促癌作用，丰富了OS分子发病机制的研究内容，也为OS的治疗提供了新的靶点。
本研究存在一定局限性。首先，本研究仅基于体外细胞实验开展，未构建体内动物模型及临床样本验证，体外实验中使用的药物浓度与体内生理代谢浓度、临床用药浓度不同，研究结果可能存在差异。其次，本研究仅聚焦于ERK1/2通路及TRIO、PKN2、CKAP5三个关键基因，未深入探究Dex是否通过其他信号通路调控OS细胞生物学行为，也未明确TRIO、PKN2、CKAP5之间的相互作用关系。此外，本研究通过蛋白互作网络分析，发现RhoA位于蛋白互作网络的中心位置，且ERK1/2并不直接调节TRIO、PKN2、CKAP5蛋白。因此，不排除ERK1/2也可通过RhoA调控TRIO、PKN2和CKAP5功能，需进一步研究以确定这种可能。
综上所述，低浓度Dex通过ERK1/2依赖性方式上调TRIO、PKN2和CKAP5的表达，从而促进OS细胞的生长与侵袭。TRIO、PKN2、CKAP5作为OS中潜在的促癌基因及预后生物标志物，为OS的靶向治疗提供了新的方向。本研究不仅丰富了Dex在肿瘤微环境中的作用研究，也为OS的临床治疗策略优化提供了重要的理论支撑与实验依据。
伦理声明：不适用
作者贡献：研究设计与论文审定：李珊珊、龚玲俐、王忠慧；实验操作与论文撰写：杨会、陈磊杰；数据采集：廖珊、龚玲俐；数据分析：赵敏、陈帘璞；研究指导与经费支持：李珊珊、杨会、陈磊 杰
数据获取：本研究中使用和(或)分析的数据可联系通信作者及在http://gepia.cancer-pku.cn/和https://david.ncifcrf.gov/网站获取
利益冲突声明：无
致谢：不适用
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