目的  分析CD226分子在子痫前期（PE）患者胎盘组织中的表达特征，及其在滋养层细胞中的生物学作用。

方法  通过qRT-PCR和免疫组织化学染色技术检测PE孕妇和正常妊娠孕妇胎盘组织中CD226的mRNA转录水平和蛋白表达。在滋养层细胞系HTR8/ SVneo和JAR中分别敲低或过表达CD226基因，评估CD226表达变化对细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响。采用Western blot检测CD226对滋养层细胞TNF-α及NF- κB p65蛋白表达的影响。

结果  相比于正常妊娠组，PE组胎盘组织中CD226表达水平显著上调。敲低CD226后，HTR8/SVneo细胞增殖、迁移和侵袭能力均增强，而细胞凋亡水平则受到抑制。过表达CD226则显著抑制JAR细胞的增殖、迁移与侵袭，并促进细胞凋亡。Western blot分析进一步揭示，过表达CD226促进滋养层细胞中TNF-α和NF-κB p65蛋白的表达。

结论  CD226在PE胎盘组织中表达水平高于正常妊娠胎盘，且具有抑制滋养层细胞增殖、迁移、侵袭以及促进其凋亡的作用。

子痫前期（preeclampsia，PE）是妊娠期高血压疾病常见亚型之一，发病率约为2%~8%[1- 2]。PE通常发生于妊娠20周后，临床特征为新发高血压及蛋白尿[3]。当前研究认为PE的发生发展主要涉及子宫螺旋动脉重塑异常、母胎界面免疫稳态失衡、血管内皮功能损伤以及孕早期滋养细胞侵袭能力受限等[4-6]。而胎盘滋养细胞侵袭能力下降导致的“胎盘浅着床”，会引发子宫螺旋小动脉重铸障碍，被视为关键的始动因素[7]。研究发现，PE具有显著的免疫学发病特征，PE母体外周血中调节性T细胞（Treg）比例及其表面CD39分子表达水平均显著降低，提示Treg功能异常及CD39可能参与PE的病理过程[8]。

CD226作为免疫调节的关键受体，主要表达于血小板、自然杀伤（NK）细胞、活化T细胞和内皮细胞表面，其表达水平与妊娠免疫稳态密切相关。研究发现，妊娠晚期CD4⁺ T细胞表面CD226表达明显低于非妊娠状态，提示CD226有助于妊娠后期母体免疫耐受[9]。在妊娠期高血压疾病中，活化的内皮细胞CD226表达显著升高，与血小板源性生长因子协同促进血管内皮损伤 [10]。重度PE患者妊娠16~20周外周血白细胞中CD226表达显著上调，与凝血纤溶异常、细胞黏附通路激活密切相关[11]。然而CD226在PE胎盘组织中的表达及其对滋养层细胞生物学特性的影响缺乏系统研究。因此本研究分析PE与正常胎盘组织中CD226的表达差异，并利用体外实验探究CD226对滋养层细胞功能的影响，旨在阐明CD226在PE发病机制中的潜在作用，为PE的临床治疗提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2024年9月至2025年5月于西北妇女儿童医院产科住院分娩的孕妇为研究对象，收集孕妇临床资料。纳入标准：①孕期在西北妇女儿童医院规律产检并完成分娩；②年龄≥18岁；③分娩孕周≥24周。排除标准：①辅助生殖技术助孕；②多胎妊娠；③合并糖尿病、慢性高血压、肾脏疾病、甲状腺疾病、自身免疫性疾病或全身性感染等。本研究已获西北妇女儿童医院医学伦理委员会批准（批号：2024-103）。

根据第10版《妇产科学》PE诊断标准，将研究对象分为正常妊娠组和PE组。产妇分娩后立即采集胎盘组织样本，液氮速冻后转移至-80 ℃超低温冰箱保存。

1.2 细胞培养

人胎盘绒毛滋养层细胞HTR8/SVneo和人胎盘绒毛癌细胞JAR购自武汉尚恩生物技术有限公司，并经STR分型鉴定。细胞培养于1640完全培养基（含10%血清，双抗）（武汉尚恩生物技术有限公司，No.SNM-001E）中，置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱培养。

1.3 细胞转染

将滋养层细胞接种于6孔板，待融合度达60%时，按照 Lipofectamine™ 2000 转染试剂（赛默飞世尔科技有限公司，No.11668019）说明书进行转染，24 h后提取RNA，48 h后提取蛋白质。CD226 siRNA的序列合成由擎科生物科技股份有限公司完成，序列如下：阴性对照si-NC：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU(dT)(dT)-3'；si1-CD226：5'-CGUCAGAUCGACCUCUUAA(dT)(dT)-3'；si2-CD226：5'-GAAUGUGUGUAUCC AUCAA(dT)(dT)-3'；si3-CD226：5'-GAGAGGAU AUUUAUGUCAA(dT)(dT)-3'。空白质粒pcDNA3.1和过表达质粒pcDNA3.1-CD226由擎科生物科技股份有限公司构建合成。

1.4 qRT-PCR

利用SteadyPure快速RNA提取试剂盒（艾科瑞生物工程有限公司，AG21023）提取细胞或组织RNA，使用PrimeScript™ RT 试剂盒（TaKaRa，RR036A）进行cDNA合成。CD226 mRNA 表达水平的定量检测通过qRT- PCR完成，采用2-ΔΔCT法计算mRNA的相对表达量。引物序列：CD226的正向引物：5'-ATAGCCAC ATTGTTTCGGAACC-3'，反向引物：5'-ATCTGAC GGGGCTGGATCTTT-3'；β-actin的正向引物：5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'；反向引物：5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'。

1.5 Western blot

收集待测细胞后，加入100 μL RIPA裂解液（碧云天生物技术股份有限公司，P0013B），冰上裂解20 min，随后于4 ℃、12 000 g条件下离心20 min，吸取上清即为总蛋白提取液，用BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术股份有限公司，P0012S）测定蛋白浓度。蛋白样品经5× loading buffer煮沸变性，经SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜（Millipore，IPVH00010）。使用5%脱脂牛奶封闭非特异性结合位点，一抗4 ℃孵育过夜。与辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育1 h后，利用化学发光成像系统（Bio-Rad）进行检测。其中一抗包括：CD226（Proteintech，17842-1-AP，1 ∶ 1 000）、NF-κB p65（Proteintech，66535-1-Ig，1 ∶ 1 000）和TNF-α（Proteintech，17590-1-AP，1 ∶ 1 000），α-tubulin（Proteintech，66031-1-Ig，1 ∶ 20 000）。二抗包括：山羊抗兔IgG（Invitrogen，31460，1 ∶ 10 000），山羊抗鼠IgG（Invitrogen，31430，1 ∶ 5 000）。

1.6 免疫组织化学染色

石蜡包埋的胎盘组织切片依次经过二甲苯、梯度乙醇后，进行柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）抗原修复。切片经0.3% H₂O2和正常山羊血清封闭，于湿盒内4 ℃一抗孵育过夜。随后，使用通用二步法检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，PV-9000）进行染色，并利用DAB试剂进行显色（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9019）。CD226的表达水平评估：染色强度评分（0：无染色；1：弱阳性；2：中等阳性；3：强阳性）与阳性染色面积评分（0：0%~25%；1：26%~50%；2：51%~75%；3：76%~100%）相乘，得到免疫组化评分。

1.7 细胞增殖实验

将转染24 h的人胎盘绒毛滋养层细胞消化后，以5 000个/孔的密度接种于96孔板中。分别在0、24、48和72 h加入含10% CCK-8溶液（南京恩晶生物科技有限公司，E1CK-000208）的新鲜培养基100 µL，37 ℃培养箱放置2 h，利用酶标仪测定450 nm波长下的吸光度。

1.8 细胞侵袭和迁移实验

将100 µL稀释的基质胶（Corning，354234）均匀铺于Transwell小室（Millipore，PI8P01250）的上室，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中孵育2 h使其凝固。采用酶消化法收获滋养层细胞，用无血清1640培养基重悬细胞，并以5×10⁴细胞/孔的密度铺种在凝胶层表面。下室加入500 µL含10 %胎牛血清的1640完全培养基。培养48 h后，使用4%多聚甲醛固定小室30 min，0.1%结晶紫染色20 min。随机选取5个视野进行显微成像和细胞计数分析。细胞迁移实验的操作步骤与侵袭实验相同，仅省略上室铺基质胶的步骤。

1.9 细胞凋亡实验

采用FITC/Annexin V-PI细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术有限公司，KGA1102-100）检测细胞凋亡。经Annexin V和PI染色后，使用Calibur 流式细胞仪（美国BD公司）分析细胞凋亡。

1.10 统计学分析

使用GraphPad Prism 5.0软件进行数据分析。计量资料采用均数和标准差（）表示，采用独立样本t检验进行组间比较；计数资料采用例数和百分比（n，%）表示，采用卡方检验进行组间比较。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CD226在正常妊娠和子痫前期孕妇胎盘组织中的表达

共纳入100例孕妇，正常妊娠组50例，PE组50例。与正常妊娠组相比，PE组新生儿体重显著降低（P＜0.05），其他（年龄、孕前BMI、孕次、产次、分娩孕周）差异无统计学意义，见表 1。qRT- PCR和免疫组织化学染色结果显示，PE组胎盘组织中CD226的mRNA（图1-A）和蛋白（图1-B）呈高表达水平，显著高于正常妊娠组。CD226表达主要呈现出胞浆与细胞核分布（图1-B）。

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  表格1 正常妊娠组和PE组孕妇一般资料的比较（x ± s）

  Table1.Comparison of general information between the PE group and the normal pregnancy group(x ± s)

  注：*计数资料以例数和百分比（n，%）表示。

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  图1 正常妊娠组和PE组孕妇胎盘组织中CD226的表达

  Figure1.The expression of CD226 in placentas of normal pregnancy and PE

  注：A.正常妊娠组和PE组孕妇胎盘组织中CD226 mRNA表达；B.正常妊娠组和PE组孕妇胎盘组织IHC染色代表图及定量分析（放大倍数： ×200）；标尺：50 μm；*P<0.05；***P<0.001。

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2.2 滋养层细胞中敲低或过表达CD226表达效率验证

进一步检测人滋养层细胞系HTR8/SVneo和JAR中CD226表达水平，结果显示HTR8/SVneo细胞中CD226 mRNA和蛋白水平均高于JAR细胞（图2-A和图2-B）。为研究CD226分子的功能，靶向设计CD226 siRNA转染高表达CD226的HTR8/SVneo细胞。结果显示，si1-CD226和si2- CD226可降低CD226 的mRNA和蛋白表达水平（图2-C和图2-D）。同时，过表达质粒pcDNA3.1-CD226可显著提高JAR细胞的CD226 mRNA和蛋白表达（图2-E和图2-F）。

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  图2 CD226敲低和过表达效率的验证

  Figure2.Verification of the knockdown and overexpression efficiency of CD226

  注：A.CD226在滋养层细胞HTR8/SVneo和JAR中的mRNA表达；B.CD226在滋养层细胞HTR8/SVneo和JAR中的蛋白表达；C.CD226在HTR8/ SVneo细胞中敲低效率的mRNA检测；D.CD226在HTR8/SVneo细胞中敲低效率的蛋白检测；E.CD226在JAR细胞中过表达效率的mRNA检测；F.CD226在JAR细胞中过表达效率的蛋白检测；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

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2.3 敲低CD226对HTR8/SVneo细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

CCK-8实验结果表明，相较于对照组，敲低CD226 48 h和72 h后，HTR8/SVneo细胞的增殖能力显著增强，差异具有统计学意义（图3-A）。流式细胞术检测结果显示，敲低CD226显著抑制HTR8/SVneo细胞的凋亡水平（图3-B）。Transwell迁移和侵袭实验结果表明，敲低CD226后，HTR8/SVneo细胞的迁移和侵袭能力均显著增强（图3-C）。

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  图3 敲低CD226对HTR8/SVneo细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响

  Figure3.The impact of CD226 knockdown on the proliferation, apoptosis, migration and invasion capabilities of HTR8/SVneo cells

  注：A.CCK-8法检测敲低CD226对HTR8/SVneo细胞增殖能力的影响；B.流式细胞术检测敲低CD226对HTR8/SVneo细胞凋亡的影响；C.Transwell实验检测敲低CD226对HTR8/SVneo细胞迁移和侵袭能力的影响；标尺：100 μm；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

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2.4 过表达CD226对JAR细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

CCK-8实验结果表明，与对照组相比，过表达CD226的 JAR细胞在培养48 h和72 h后增殖能力显著降低（图4-A）。流式细胞术检测结果显示，过表达CD226显著增加JAR细胞凋亡水平（图4-B）。Transwell迁移和侵袭实验结果表明，过表达CD226显著抑制JAR细胞的迁移和侵袭能力（图4-C）。以上结果表明CD226促进人滋养层细胞的凋亡，抑制滋养层细胞的增殖和运动。

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  图4 过表达CD226对JAR细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响

  Figure4.The impact of CD226 overexpressed on the proliferation, apoptosis, migration and invasion capabilities of JAR cells

  注：A.CCK-8法检测过表达CD226对JAR细胞增殖能力的影响；B.流式细胞术检测过表达CD226对JAR细胞凋亡的影响；C.Transwell实验检测过表达CD226对JAR细胞迁移和侵袭能力的影响；标尺：100 μm；*P<0.05；**P<0.01。

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2.5 CD226对滋养层细胞中TNF-α/NF-κB信号通路的影响

为探究CD226对TNF-α/NF-κB信号通路的调控作用，本研究分别在HTR8/SVneo和JAR细胞中敲低和过表达CD226并检测炎症相关蛋白的表达。结果显示，在HTR8/SVneo细胞中，敲低CD226可下调TNF-α和NF-κB p65的蛋白水平；而在JAR细胞中过表达CD226可上调TNF-α和NF-κB p65蛋白的表达（图5）。

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  图5 敲低或过表达CD226对滋养层细胞中TNF-α和NF-κB p65蛋白表达的影响

  Figure5.The effect of knockdown or overexpression of CD226 on the protein expression of TNF-α and NF-κB p65 in trophoblast cells

  注：A.Western blot检测敲低CD226后HTR8/SVneo细胞中TNF-α和NF-κB p65蛋白表达的变化；B.Western blot检测过表达CD226后JAR细胞中TNF-α和NF-κB p65蛋白表达的变化。

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3 讨论

PE发病机制复杂，其病因具有异质性，严重危害母胎健康。研究表明，PE主要与母胎界面免疫过度激活、胎盘滋养层细胞增殖和侵袭受阻相关，导致子宫螺旋动脉重塑不足及胎盘浅着床 [12- 13]。此外，炎性介质介导的血管内皮损伤及血管痉挛也参与其发生发展[13-14]。

CD226是免疫球蛋白超家族分子，为Ⅰ型跨膜糖蛋白，其胞外区含两个V样结构域，胞内区则包含多个功能基序：结合蛋白酪氨酸磷酸酶2（PTP2）的EDIYVNY基序、被酪蛋白激酶Ⅱ和蛋白激酶C（PKC）识别的S/T结构域，以及结合PDZ结构域蛋白的KTRV基序，共同介导活化信号传导，对CD226的功能至关重要[15]。CD226广泛表达于T细胞、NK 细胞、巨噬细胞和内皮细胞等，通过与T细胞免疫球蛋白和CD96竞争性结合配体CD155和CD112参与免疫调节 [16- 17]。CD226可促进巨噬细胞M1型极化，并通过VAV1/Akt/Foxo1/PPARγ信号通路参与肥胖相关脂肪组织炎症[18]。在内皮细胞中，CD226通过抑制Glut1表达和葡萄糖摄取影响糖代谢[19]。同时，CD226通过活化CD8⁺ T细胞功能参与多种自身免疫性疾病的免疫损伤过程[20]。虽有研究表明重度PE患者外周血CD226表达上调，但其在PE胎盘组织中的表达和功能尚不清楚[11]。本研究发现CD226在PE患者胎盘组织中表达升高，抑制胎盘滋养细胞的增殖、侵袭和迁移能力，并促进其凋亡，其可能是导致胎盘浅着床和子宫螺旋动脉重铸不足的关键分子。

既往研究发现，PE与母体及母胎界面炎症因子异常表达和活化密切关联[21-22]。炎症因子TNF-α表达上调可激活包括NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在内的炎症信号，促进炎症因子级联反应[23-24]。多项研究证实PE患者外周血和胎盘组织中TNF-α和NF-κB表达显著升高，其介导的过度炎症反应通过减弱滋养细胞侵袭能力参与PE发病[25-26]。本研究发现，CD226通过促进胎盘滋养细胞产生TNF-α等炎性因子，激活NF-κB通路，使胎盘源性的炎性介质进入母体循环，激活母体内皮细胞和免疫细胞，导致广泛的血管内皮损伤、炎症级联反应和血管痉挛[13]。因此，CD226可能是连接PE发病两阶段的关键分子：在胎盘局部加剧滋养细胞功能障碍和炎症启动；通过调控炎症因子释放，驱动和放大母体系统性炎症反应。

本研究存在一定局限性。首先，样本量较小且为单中心研究，未来需进行大样本、多中心研究以增加结果的客观性，并深入探讨CD226与PE严重程度的关系。其次，CD226调控TNF-α和NF-κB p65等炎症因子表达的具体分子机制仍需进一步阐明。

综上所述，本研究初步证实CD226在PE胎盘组织中高表达，通过抑制滋养层细胞增殖、侵袭和迁移功能及促进凋亡参与疾病进程，其机制可能与TNF-α/NF-κB通路活化有关，本研究聚焦的CD226分子有望成为PE干预的新靶点。

伦理声明：本研究已获西北妇女儿童医院医学伦理委员会批准（批号：2024-103）

作者贡献：研究设计：张明、余洋；实验操作：余洋、白金博、冯丹；样本收集：徐晓艳、王博；数据分析：余洋、刘泽昆、徐晓艳；论文审定：张明；经费支持：张明、刘泽昆

数据获取：本研究中使用和（或）分析的数据可联系通信作者获取

利益冲突声明：无

致谢：不适用

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