目的  探讨E3泛素蛋白连接酶TRIM7对鼠源性骨髓巨噬细胞（BMDMs）来源泡沫细胞脂质积累的影响及机制。

方法  Western blot和qRT-PCR检测氧化型低密度脂蛋白刺激BMDMs后TRIM7的表达变化；构建TRIM7敲除的BMDMs和TRIM7过表达的THP-1细胞系，通过qRT-PCR、油红O染色和总胆固醇含量检测分析TRIM7对BMDMs脂质代谢的影响；Western blot检测TRIM7敲除后BMDMs中MAPK信号通路蛋白的磷酸化水平；免疫共沉淀检测TRIM7与MAPK通路上游激酶TAK1的相互作用。

结果  TRIM7与TAK1存在直接相互作用，TRIM7敲除可通过增强MAPK信号通路蛋白的磷酸化活性，上调CD36和MSR1表达并抑制ABCA1表达，增加胆固醇摄取并减少脂质排出，最终促进泡沫细胞形成。

结论  TRIM7通过直接结合TAK1抑制MAPK信号通路及清道夫受体表达，负向调控泡沫细胞脂质积累，为动脉粥样硬化的治疗提供了潜在的新靶点方向。

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种慢性炎症性疾病，其特征是大中型动脉壁上形成的脂质条纹，逐渐发展为影响血流的斑块，增加血栓形成风险并引起一系列临床疾病，如冠心病、外周血管疾病和卒中等[1]。据世界卫生组织报道，2019年全球有1 860万人死于心血管疾病，给患者、家庭和社会带来严重的医疗负担[2]。高血脂、血糖、吸烟、糖尿病等都是AS的危险因素[3]。AS的病理机制复杂，在AS起始阶段，血液中的低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）在血管壁中被氧化为氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）[4]。ox-LDL趋化单核细胞到血管内膜下形成巨噬细胞，巨噬细胞通过人类白细胞分化抗原36（cluster differentiation 36，CD36）不受负反馈的吞噬ox-LDL，形成泡沫细胞。泡沫细胞的大量聚集触发了炎症反应、平滑肌细胞迁移和内皮功能损 害 [5]。

E3 泛素蛋白连接酶TRIM7（tripartite motif containing 7）是三结构域蛋白（TRIM）家族的成员，该家族蛋白结构保守，具有泛素连接酶活性和广泛的生物学功能（如细胞焦亡、凋亡、炎症、自噬和免疫功能等）[6]。转化生长因子-β激活激酶1（transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1）是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族的成员,参与广泛的生理病理调节过程。TAK1在MAPK的激活中起着至关重要的作用[7]。关于TRIM7在AS中的作用已有报道，但TRIM7在巨噬细胞来源泡沫细胞中的表达及机制尚未明确。本研究通过探究TRIM7对泡沫细胞表型的影响，初步探索其作用机制，以期为AS的治疗提供新的实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

DMEM培养基、胎牛血清、胰酶、青霉素-链霉素双抗购自武汉普诺赛生命科技有限公司。反转录试剂、SYBR Green PCR试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。RIPA细胞裂解液、油红O染色试剂盒、聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）转染试剂、聚凝胺（polybrene）购自上海碧云天生物技术有限公司。靶向TRIM7的敲低和过表达质粒购于上海吉玛制药技术有限公司。ox-LDL购自广州奕源生物科技有限公司。TRIM7抗体、CD36抗体、GAPDH抗体、ERK抗体、JNK抗体、p38抗体、p-ERK抗体、p-JNK抗体、p-p38抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。BCA蛋白定量试剂盒、总胆固醇检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞来源及培养

人单核细胞THP-1、人胚肾细胞293T购于中国科学院细胞库，鼠源性骨髓巨噬细胞（BMDMs）由武汉大学基础医学院张鹏课题组捐赠。所有细胞在5% CO2、恒温37 ℃环境中培养，完全培养基成分为DMEM培养基混合10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。

1.2.2 泡沫细胞模型构建

将BMDMs置于含50 µg/mL ox-LDL的培养基中培养48 h 以诱导泡沫细胞形成。镜下观察细胞形态，并通过油红O染色鉴定细胞内脂质积聚。佛波酯（PMA）处理THP-1细胞48 h，以诱导其分化为巨噬细胞，再使用ox-LDL诱导泡沫细胞形成。

1.2.3 油红O染色

多聚甲醛固定细胞20 min，随后异丙醇通透15 min。风干异丙醇后，加入油红O工作液室温染色20 min，清洗后用苏木素复染细胞核。最后返蓝并封片，于显微镜下观察拍照。

1.2.4 RT-qPCR实验

收集细胞后，使用Trizol法提取总RNA并反转录为cDNA。采用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒，通过2^-△△CT法分析目标基因mRNA的相对表达水平。鼠源TRIM7上游引物序列为：5'-GCTCGGGGTTGAGATCACC-3'，下游引物序列为5'-CCAGGCACATTGCTACACCT-3'；鼠源GAPDH上游引物序列为：5'-GTGGCAA AGTGGAGATTGTTG-3'，下游引物序列为：5'-CGTTGAATTTGCCGTGAGTG-3'；鼠源MSR1上游引物序列为：5'-CAGGCAGAGGAA GGTGACAA-3'，下游引物序列为：5'-CGGGTC CTTGAGATTGTCCT-3'；鼠源ABCA1上游引物序列为：5'-GCCTGGGACAAGTTCTACCC-3'，下游引物序列为：5'-CAGTCGGGTTGAAGCGTC-3'。

1.2.5 Western blot实验

使用含磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取细胞总蛋白，经95 ℃金属浴热变性和离心后，进行SDS-PAGE凝胶分离并转膜至PVDF膜。采用5%脱脂牛奶封闭1 h后，使用一抗（TRIM7、GAPDH、CD36、ERK、JNK、p38、p-ERK、p-JNK、p-p38）在4 ℃孵育过夜，用1×TBST洗涤三次，二抗孵育1 h。1×TBST洗膜后，通过化学发光显影，ImageJ软件对条带进行灰度值定量分析。

1.2.6 总胆固醇检测

泡沫细胞模型构建成功后，使用冰浴超声波破碎细胞。根据总胆固醇测定试剂盒配置胆固醇的标准品溶液。向96孔板中的测定管、标准管和空白管依次加入样本、标准溶液和提取液各10 µL，向各孔加入工作液500 µL，37 ℃静置30  min，反应完成后吸取200 µL于96孔板中，测定500 nm处吸光值，绘制标准曲线，计算总胆固醇含量。

1.2.7 细胞转染

将1×10⁶个THP-1细胞均匀接种至6孔板进行质粒转染，慢病毒包装质粒pSPAX2、pMD2. G与目的基因质粒以1 ∶ 1 ∶ 2的比例，利用PEI转染至293T细胞。转染48 h或72 h后收集病毒上清并过滤。利用聚凝胺将所得病毒液感染THP-1细胞，并使用嘌呤霉素进行连续筛选，将筛选后的细胞进行扩增，采用Western blot检测是否构建成功，最终获得稳定表达的细胞系。

1.2.8 免疫共沉淀

RIPA裂解缓冲液裂解细胞，离心后吸取上清，加入抗体孵育过夜。随后加入预先洗涤的琼脂糖珠4 ℃孵育4 h。使用洗涤液洗涤琼脂糖珠，最后加入2×SDS上样缓冲液，金属浴煮沸，经过SDS-PAGE分离，使用Western blot实验确定结合蛋白。

1.3 统计学分析

应用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析，数据均采用均数和标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 泡沫细胞模型中TRIM7的蛋白及mRNA表达

为阐明TRIM7在ox-LDL诱导的泡沫细胞形成中的作用机制，本研究采用ox-LDL处理BMDMs 48 h。结果显示，ox-LDL处理显著抑制了TRIM7的表达，表现为mRNA水平（图1-A）和蛋白水平（图1-B）的同步下调，结果提示，ox-LDL可能通过转录调控途径抑制TRIM7的表达。

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  图1 BMDMs泡沫细胞模型中TRIM7的表达情况

  Figure1.The expression of TRIM7 in BMDMs foam cell model

  注：A.BMDMs经ox-LDL处理后TRIM7的mRNA表达情况；B.BMDMs经ox-LDL处理后TRIM7蛋白鉴定结果及蛋白印迹定量分析；**P＜0.01。

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2.2 敲除TRIM7对BMDMs脂质蓄积的影 响

为研究TRIM7对BMDMs来源泡沫细胞脂质积累的影响，本研究构建TRIM7敲除的BMDMs，并通过Western blot验证了基因敲除效率（图2-A）。采用油红O染色评估BMDMs泡沫化程度，结果显示，与对照组相比，TRIM7敲除组的BMDMs表现出脂滴数量增加以及染色加深（图2-B）。进一步定量分析显示，TRIM7敲除组细胞内的总胆固醇含量较对照组升高（图2-C）。这些结果共同表明，TRIM7缺失会促进BMDMs内脂质蓄积，进而加速泡沫细胞的形成过程。

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  图2 TRIM7敲除后BMDMs脂质积累情况

  Figure2.Lipid accumulation in BMDMs after TRIM7 knockout in mice

  注：A.TRIM7敲除的蛋白鉴定结果；B.TRIM7敲除后BMDMs油红O染色结果图及定量分析；C.TRIM7敲除后BMDMs内总胆固醇含量检测结果；** 与shNC Control相比，P＜0.01；##与shNC ox-LDL相比，P＜0.01。

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2.3 过表达TRIM7对巨噬细胞脂质蓄积的影响

为进一步探讨TRIM7对泡沫细胞脂质积累的影响，构建TRIM7过表达细胞系，并通过Western blot检测TRIM7表达水平（图3-A）。油红O染色分析表明，TRIM7过表达与对照组相比可显著抑制巨噬细胞内脂滴的形成（图3-B）。此外，细胞内总胆固醇检测结果显示，TRIM7过表达降低了细胞内总胆固醇含量（图3-C）。综上所述，TRIM7过表达显著减少了巨噬细胞内脂质的积累，抑制了泡沫细胞的形成。

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  图3 THP-1细胞系TRIM7过表达后脂质积累情况

  Figure3.Lipid accumulation after TRIM7 overexpression in the THP-1 cell line

  注：A.THP-1细胞系TRIM7过表达效率的蛋白鉴定结果；B.THP-1细胞系TRIM7过表达后油红O染色结果图及定量分析；C.THP-1细胞系TRIM7过表达后细胞内总胆固醇含量检测结果；**与Vector Control相比，P＜0.01；##与Vector ox-LDL相比，P＜0.01。

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2.4 TRIM7对BMDMs清道夫受体表达的影 响

巨噬细胞表面CD36受体是关键的脂质摄取受体，为探究TRIM7对CD36的调控作用，构建泡沫细胞模型。Western blot结果显示，TRIM7缺失显著上调了CD36蛋白表达（图4-A）。进一步通过qRT-PCR检测发现，TRIM7敲除不仅上调了CD36和清道夫受体1（MSR1）的mRNA水平，同时抑制了ATP结合盒转运体A1（ABCA1）的表达（图4-B），清道夫受体表达的协同改变共同促进了细胞内脂质蓄积。

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  图4 BMDMs TRIM7敲除后清道夫受体表达情况

  Figure4.The expression of scavenger receptors in BMDMs after TRIM7 knockout

  注：A.敲除TRIM7后BMDMs中CD36蛋白的表达情况和蛋白印迹定量分析；B.敲除TRIM7后BMDMs中CD36、MSR1和ABCA1的mRNA表达情况；**P＜0.01。

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2.5 TRIM7对BMDMs MAPK信号通路的影响

为阐明TRIM7对MAPK信号通路的调控作用，本研究采用BMDMs构建泡沫细胞模型。通过WB检测MAPK信号通路关键蛋白的磷酸化水平，结果显示与对照组相比，TRIM7敲除组BMDMs中P38、JNK和ERK磷酸化水平均显著升高（图5），表明TRIM7缺失可显著增强MAPK信号通路的活化状态。

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  图5 BMDMs TRIM7敲除后MAPK信号通路磷酸化水平及定量分析

  Figure5.Phosphorylation of the MAPK signaling pathway in BMDMs after TRIM7 knockout

  注：**P＜0.01。

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2.6 TRIM7与TAK1存在蛋白互作

为阐明TRIM7在MAPK信号通路中的调控机制，利用免疫共沉淀实验证实TRIM7与MAPK通路上游关键激酶TAK1存在直接相互作用，可能提示TRIM7可通过TAK1影响MAPK信号通路的活化（图6）。

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  图6 TRIM7与MAPK通路上游关键激酶TAK1互作情况

  Figure6.The interaction between TRIM7 and TAK1

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3 讨论

AS斑块是一种慢性低度炎症性疾病，巨噬细胞在病变进展中能促进炎症反应并加剧脂质沉积 [8]。疾病进展中，巨噬细胞向泡沫细胞的转化缺乏有效调控，其失控的脂质摄取易诱发凋亡，继而通过继发性坏死释放大量脂质，推动斑块坏死核心形成[9]。

本研究揭示了TRIM7作为脂质代谢负调控因子的重要作用，其通过双向调控胆固醇摄取与外排通路抑制泡沫细胞形成。TRIM7是一种RING结构域E3泛素连接酶，在巨噬细胞、B细胞和T细胞等免疫细胞中呈高表达[10]。多项研究表明，TRIM7不仅在宿主抵御病原体感染的先天免疫应答中发挥关键作用，还广泛参与调控多种细胞生物学过程，包括细胞增殖、凋亡、侵袭转移以及炎症反应等 [11]。在心血管疾病中，TRIM7可以激活其中的c-Jun/AP-1信号通路，促进AS病变中血管平滑肌细胞的异常增殖和迁移[12]。本研究证实TRIM7的敲除会加剧脂质蓄积，而过表达则发挥抑制效应。敲除TRIM7一方面通过上调CD36与MSR1受体的表达以促进脂质摄取，另一方面下调ABCA1受体以抑制胆固醇流出。这种摄取增强与外排抑制的共同作用导致细胞内脂质蓄积加剧，从而促进泡沫细胞形成。

在TRIM7参与泡沫细胞脂质代谢调控的机制研究中，本研究进一步探讨了TRIM7在MAPK信号通路中的作用。既往研究表明，在AS斑块的巨噬细胞富集区域，P38 MAPK的磷酸化水平显著升高[13]。值得注意的是，尽管抑制P38 MAPK能够诱导巨噬细胞凋亡，但这种抑制可能加速斑块坏死进程[14]。在脂质代谢方面，P38 MAPK通过上调巨噬细胞表面CD36受体的表达，促进脂质摄取[15]；抑制该通路则能够有效减轻细胞内脂质蓄积，从而延缓泡沫细胞的形成。此外，斑块组织的巨噬细胞中的ERK通路呈现持续性激活，这一通路不仅通过调节Kv1.3通道影响细胞功能，还能上调IL-6和TNF-α等促炎因子的表达[16]。更重要的是，ERK信号在调控巨噬细胞对ox- LDL的摄取、极化表型转换及凋亡过程中发挥关键作用[17-18]，构成了复杂的炎症-代谢调控网络。同时，TRIM家族在炎症免疫等生物学行为中发挥着重要作用。例如，TRIM5已被证明可以通过靶向TAK1 结合蛋白2（TAB2）和TAB3的降解从而负向调节 NF-κB的激活[19]。此外，TRIM5参与调控TAK1激酶和 AP-1信号通路，介导炎性细胞因子的转录[20]。TRIM21在被细胞内抗体信号激活后，会催化泛素链的形成，刺激NF- κB、AP-1、IRF3、IRF5等炎症信号分子的产生[21]。同时，TRIM21参与AS的进展，其机制是TRIM21会与内皮细胞中的MAPK6相结合，促进其泛素化降解，减缓内皮炎症[22]。在既往的研究中，TRIM26通过结合并泛素化伴侣 TAK1 结合蛋白，进而增强激活TAK1以及MAPK信号通路 [23]。在心脏纤维化中，TRIM38可以降解TAB2和TAB3，进而抑制TAK1 磷酸化，从而负向调节MAPK信号通路[24]。本研究发现，E3泛素连接酶TRIM7是MAPK信号通路的重要调控分子。TRIM7通过直接结合TAK1负向调控MAPK，下调CD36表达，从而减少脂质摄取，最终有效抑制泡沫细胞的形成。此发现为理解AS的分子机制提供了新的理论依 据。

本研究局限性在于TRIM7的功能仅在细胞层面得到验证，而未在复杂的体内环境中进行系统评估。未来需要构建TRIM7基因敲除小鼠的AS模型，通过对斑块面积、组成等关键指标进行定量分析，以深入揭示其体内的作用机制。此外，本研究虽证实了TRIM7与TAK1的相互作用，但其具体的泛素化修饰类型与功能尚不明确。同时，TRIM7经TAK1调控MAPK通路的分子机制仍有待进一步研究。

综上所述，本研究揭示了TRIM7在巨噬细胞源性泡沫细胞调节过程中的功能。研究发现TRIM7通过与TAK1结合负向调控MAPK信号通路抑制泡沫细胞形成，为TRIM7作为潜在治疗靶点提供了初步证据。

伦理声明：不适用

作者贡献：实验操作、数据采集、论文撰写：赵艺琳、杨懿；图像分析与处理：蔡泽鸣、杨懿；查阅文献、文章修改与审阅：蔡泽鸣、侯博文；研究指导、经费支持：朱丽华

数据获取：本研究中使用和（或）分析的数据可联系通信作者获取

利益冲突声明：无

致谢：不适用

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