目的  探讨蜂毒肽（melittin）联合光动力疗法（PDT）抑制黑色素瘤细胞（B16-F10）生物学行为的作用。

方法  使用水合法制备纳米药物蜂毒肽光敏脂质纳米颗粒（α-melittin-PPIX-NP）并对其进行表征，红细胞溶血实验验证蜂毒肽溶血副作用，CCK-8检测其联合PDT杀伤B16-F10细胞能力，Western Blot实验检测清道夫受体蛋白1在不同细胞中的表达情况，流式细胞术检测细胞凋亡、不同细胞对药物的摄取量和体外活化小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）。

结果 制备的α-melittin-PPIX-NP 形貌较为均一，水合粒径分布较为集中，明显减轻了红细胞溶血副作用。α-melittin-PPIX-NP高效靶向B16-F10细胞，通过活化BMDCs抑制肿瘤细胞增殖，而其联合近红外光（NIR）进行PDT时效果更好。

结论  α-melittin-PPIX-NP联合NIR进行PDT，可以促进B16-F10细胞凋亡，活化BMDC，有效增加抗肿瘤免疫作用。

黑色素瘤的全球发病率和死亡率呈逐年上升趋势，预计到2040年，每年将新增51万例黑色素瘤患者和9.6万死亡病例[1]。黑色素瘤不仅严重影响患者的生活质量和生存率，也会造成极高的治疗和管理成本[2-4]。因此，加强对此类皮肤癌的研究，对于减轻其社会和经济影响至关重 要。

蜂毒肽（melittin）是来源于蜜蜂毒素的多肽类物质，由26个氨基酸残基组成，具有抗肿瘤活性[5-6]。通过与肿瘤细胞接触，在其细胞膜上“打孔”，从而使肿瘤细胞内容物外泄，达到抗肿瘤效果。但由于溶血副作用，难以直接利用蜂毒肽进行抗肿瘤治疗[6]。如何有效地将蜂毒肽定向递送至肿瘤细胞，并减少其对正常细胞的毒性是当前研究的重点。增加α-螺旋linker结构，可以降低蜂毒肽对红细胞的破坏性，还增强对特定肿瘤细胞的靶向能力，特别是高表达B类1型清道夫受体（scavenger receptor class B type 1，SR-B1）的B16-F10黑色素瘤细胞[7]。SR-B1受体是一种多配体膜受体蛋白，主要介导高密度脂蛋白衍生的胆固醇酯选择性进入细胞[8]。在肿瘤治疗中，SR-B1通过促进肿瘤细胞选择性吸收胆固醇，与多种肿瘤的发生发展高度相关[9-10]。

光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）是利用特定的光敏剂和特定波长的光照射来激活光敏剂，产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），从而选择性地杀死肿瘤细胞 [11]。该技术因其高度的靶向性和可控性，以及较低的副作用而被广泛应用[12]。近年来，结合PDT和其他治疗方法[13]，如化疗、放疗或生物治疗，已显示出在增强抗肿瘤效果方面的潜力[14]。本研究皆在探讨蜂毒肽联合PDT对黑色素瘤细胞生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

Fe3O4、DMPC和MHPC购自上海源叶生物科技有限公司；光敏剂原卟啉IX（protoporphyrin IX，PPIX）购于上海笛柏生物科技有限公司；三氯甲烷购自上海国药集团化学试剂有限公司；α-melittin多肽购自合肥国肽生物科技有限公司；B16-F10细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心细胞库，LDLA7细胞（低表达SR-B1）和SR-B1细胞（高表达SR-B1）受赠于华中科技大学光电实验室；1640培养基和DMEM/F-12培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；青/链霉素双抗购自安徽Biosharp生物科技有限公司；Hochest 33342购自北京索莱宝科技有限公司；蛋白裂解液、BCA蛋白检测试剂盒和CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；CD11c抗体、CD86抗体、MHC Ⅱ抗体和β-actin抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和SR-B1抗体购自英国Abcam抗体公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

使用含1%青霉素-链霉素双抗和10% FBS的1640培养基培养B16-F10细胞，使用含1%青链霉素双抗和10% FBS的DMEM/F-12培养基培养LDLA7细胞和SR-B1细胞。在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养细胞。当细胞融合度达到80%~90%时，使用胰酶消化传代。

1.2.2 纳米药物蜂毒肽光敏脂质纳米颗粒（α-melittin-PPIX-NP）的制备

分别称取10mg Fe₃O₄、10 mg磷脂DMPC、10  mg磷脂MHPC和500 mg光敏剂PPIX，加入200 μL氯仿，超声溶解，将溶解后的材料全部混匀备用。烧瓶中装入20 mL生理盐水溶液，置于磁力加热搅拌器上加热搅拌，当水温升至65  ℃时，用移液器逐滴缓慢加入混匀的材料。加热搅拌3 h后，2 000 rpm离心5 min，收集上清，重复离心3次，除去未结合的氧化铁。使用10 K超滤管，将溶液体积浓缩至1 mL。向上述1  mL溶液中加入6 mg α-melittin多肽，放入冰盒中，摇床孵育2 h。随后4 ℃、50 000 rpm超速离心机离心60 min，保留沉淀，重复离心3次，去除游离的α-melittin多肽。在无菌操作台中使用0.22  μm的滤器过滤溶液，使溶液终体积为1 mL。4 ℃避光保存备用。

1.2.3 材料表征

使用透射电子显微镜（TEM）观察α-melittin-PPIX-NP形貌结构；利用马尔文纳米粒度分析仪测量α-melittin-PPIX-NP的水合粒径。

1.2.4 红细胞溶血实验

将正常小鼠麻醉，取血，将小鼠血液用10  mL生理盐水重悬，2 000 rpm离心5 min，保留红细胞沉淀，重复离心3次。用生理盐水将红细胞数量稀释至1×10⁷个/mL。分别向EP管中加入500 μL红细胞悬液，然后再向各EP管中加入不同浓度的melittin，其中每组设1个1% TritonX-100（Biosharp）作为阳性对照。在37 ℃培养箱中孵育2 h后，取出EP管进行离心，12  000 rpm离心10 min，对比各组的溶血情况。再分别取100 μL上清，在540 nm波长下测各自吸光度。本研究已分别获得武汉市红十字会医院伦理委员会（批号：2021023）和华中农业大学伦理委员会（批号：HZAUMO-2024-0334）审核批准。

1.2.5 Western Blot检测在不同细胞中的SR-B1受体蛋白表达情况

用六孔板培养LDLA7细胞、SR-B1细胞和B16-F10细胞，待细胞密度接近80%，用蛋白裂解液裂解各组细胞，提取总蛋白，用BCA试剂盒检测各组细胞蛋白浓度。向各组蛋白加入5×溴酚蓝（Biosharp），100 ℃变性10 min。蛋白上样量20 μg/孔，电泳：80 V，30 min；120 V，约40  min。转膜：200 mA，2 h。PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭1 h，再用1×TBST缓冲液洗PVDF膜3次。孵育一抗，4 ℃过夜。次日用1×TBST缓冲液洗PVDF膜3次。加入二抗，室温孵育1 h。用ECL化学发光液在化学凝胶成像系统进行显影成像。

1.2.6 CCK-8实验

将B16-F10细胞按8 000个/孔铺到96孔板中，每组设5个复孔。将细胞分别设置为单独α-melittin组（α-melittin组）、α-melittin联合近红外光照组（α-melittin+NIR组）、α-melittin和PPIX自组装纳米颗粒组（α-melittin-PPIX-NP组）和α-melittin和PPIX自组装纳米颗粒联合近红外光照组（α-melittin-PPIX-NP+NIR组）。分别加入α-melittin和α-melittin-PPIX-NP培养3 h，更换各孔培养基，其中NIR组使用660 nm激光机照射5  min，然后继续培养21 h。分别向各孔加入10 μL CCK-8溶液，培养箱中继续避光培养4 h，使用酶标仪在450 nm波长处测吸光度。

1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡

将B16-F10细胞按1×105个/孔铺到6孔板内，分为PBS组、PBS+NIR组、α-melittin- PPIX-NP组和α-melittin-PPIX-NP+NIR组，α-melittin-PPIX-NP组和α-melittinPPIX-NP+NIR组分别加入2  μM α-melittin-PPIX-NP，继续在细胞培养箱中培养3 h后，使用660 nm激光器对PBS+NIR组、α-melittin-PPIX-NP+NIR组进行照射2 min。加入α-melittin-PPIX-NP 24 h后，收集细胞，使用预冷的PBS冲洗，1 200 rpm，离心5 min，弃上清液，100 μL 结合缓冲液制细胞悬液，依次加入Annexin V-FITC和PI染色液各5 μL，室温避光孵育20 min。加入400 μL 结合缓冲液混悬细胞，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.8 激光扫描共聚焦显微镜观察细胞摄取药 物

将B16-F10细胞中加入1 μM的α-melittin-PPIX-NP培养，避光培养，培养时间分别为0、3、6、12 h。当每组到各自的培养时间时，再加入Hochest 33342染细胞核15  min，然后用4%的多聚甲醛固定过夜，将固定好的细胞在蔡司LSM710激光共聚焦显微镜（CLSM）上观察，使用350 nm和660 nm波长激发，观察药物在细胞内的分布情况。

1.2.9 流式细胞仪检测细胞对α-melittin-NP 的摄取情况

用5 μM的α-melittin-PPIX-NP分别培养B16-F10细胞、SR-B1细胞和LDLA7细胞3 h，移去原有培养基，用PBS轻轻洗3次。然后再重新添加完全培养基继续培养21 h，用胰酶消化处理后置入细胞流式仪，选择660 nm激发波长，观察各组细胞对α-melittin-PPIX-NP的摄取情况。

1.2.10 对BMDC细胞的活化

取8周龄、雄性C57小鼠骨髓细胞，用含GM-CSF的1640完全培养基培养7 d，骨髓细胞分化为骨髓来源树突状细胞（BMDC）。将BMDC细胞接种到6孔板中，分别设置PBS组、α-melittin-PPIX-NP组、α-melittin-PPIX-NP+NIR组和脂多糖处理的阳性对照组（LPS组）。加入上述各组对应药物培养3 h，更换各孔培养基，其中α-melittin-PPIX-NP+NIR组用660 nm激光机照射5 min，然后继续培养21  h。分别使用CD11c抗体标记BMDC细胞，CD86抗体和MHC  Ⅱ抗体标记成熟的BMDC细胞，使用流式细胞仪检测BMDC细胞活化率。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0软件绘图，采用SPSS 28.0软件进行统计分析。计量资料以均数和标准差（）表示，组间比较采用t检验，所有检验均为双侧检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 α-melittin-PPIX-NP表征

TEM和水合粒径观察结果显示，制备的α-melittin-PPIX-NP形貌尺寸较为均一，其平均粒径在28 nm左右（图1）。

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  图1 α-melittin-PPIX-NP透射电镜和水合粒径

  Figure1.Transmission electron microscopy and hydrated particle size of α-melittin-PPIX-NP

  注：A.α-melittin-PPIX-NP形貌的透射电镜图（标尺左：50 nm，右：20 nm）；B.α-melittin-PPIX-NP的水合粒径大小。

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2.2 α-melittin-PPIX-NP对红细胞溶血影 响

红细胞溶血实验显示，在药物浓度为0.5、1、2、5、10、20 μM时，α-melittin- PPIX-NP组较melittin组红细胞溶血减少，且各浓度溶血率差异具有统计学意义（P＜0.01），见图2。

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  图2 α-melittin-PPIX-NP减弱红细胞溶血副作用

  Figure2.α-melittin-PPIX-NP reduces the hemolytic side effects on red blood cells

  注：A.不同药物浓度下，melittin和α-melittin-PPIX-NP对红细胞的溶血作用比较；B.不同药物浓度下，melittin和α-melittin-PPIX-NP对红细胞的溶血曲线；**P＜0.01，***P＜0.001。

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2.3 SR-B1受体蛋白在不同细胞中的表达情况

WB结果显示，B16-F10细胞的SR-B1受体蛋白表达量略低于SR-B1细胞，高于LDLA7细胞，差异具有统计学意义（P ＜0.001），见图3。

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  图3 SR-B1蛋白在不同细胞中的表达情况

  Figure3.Expression of SR-B1 protein in different cells

  注：A.不同细胞的SR-B1蛋白表达；B.SR-B1蛋白在不同细胞上的表达定量分析；**P＜0.01，***P＜0.001。

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2.4 α-melittin-PPIX-NP对B16-F10细胞增殖的抑制作用

CCK-8实验结果显示，α-melittin组与α-melittin联合NIR组细胞活性差异无统计学意义，说明使用的近红外光NIR对B16-F10细胞无明显细胞毒性；α-melittin-PPIX-NP组与α-melittin-PPIX-NP+NIR组细胞活性具有显著差异（P＜0.01），见图4。

• 
  图4 α-melittin-PPIX-NP对B16-F10细胞活性的影响

  Figure4.The effect of α-melittin-PPIX-NP on the activity of B16-F10 cells

  注：不同药物和处理对肿瘤细胞生长活力的影响；n.s无显著差异，**P＜0.01。

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2.5 α-melittin-PPIX-NP对B16-F10细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果表明，PBS+NIR组细胞凋亡比例显著高于PBS组，差异具有统计学意义（P ＜0.001）；α-melittin-PPIX-NP+NIR组与α-melittin-PPIX-NP组比较，两组间细胞凋亡比例具有显著统计学差异（P＜0.001），见图5。

• 
  图5 α-melittin-PPIX-NP对B16-F10细胞凋亡的影响

  Figure5.The effect of α-melittin-PPIX-NP on the apoptosis of B16-F10 cells

  注：A.细胞流式检测细胞凋亡；B.细胞流式检测细胞凋亡定量分析；***P＜0.001。

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2.6 细胞对α-melittin-PPIX-NP摄取

激光共聚焦结果显示，在0、3、6、12 h时间点，B16-F10细胞摄取α-melittin-PPIX-NP量随着孵育时间递增，且荧光信号也未衰减，说明α-melittin-PPIX-NP被B16-F10细胞摄入后，较长时间内具有良好的稳定性，见图6。

• 
  图6 B16-F10细胞摄取α-melittin-PPIX-NP的共聚焦成像

  Figure6.Confocal image of B16-F10 cells uptake of α-melittin-PPIX-NP

  注：标尺.400 μm。

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2.7 流式细胞仪检测不同细胞对α-melittin- PPIX-NP摄取

流式细胞仪结果显示，在不同浓度的 α-melittin-PPIX-NP孵育时，B16-F10细胞摄入α-melittin-PPIX-NP量远多于LDLA7细胞组，差异具有统计学意义（P ＜0.05）；B16-F10细胞摄入α-melittin- PPIX-NP量少于SR-B1细胞组，差异具有统计学意义（P ＜0.05），见图7。

• 
  图7 流式细胞仪检测不同细胞对α-melittin-PPIX-NP的摄入量

  Figure7.Flow cytometry detection of the intake of α-melittin-PPIX-NP by different cells

  注：A.细胞流式检测不同细胞对α-melittin-PPIX-NP的摄取；B.不同细胞摄取α-melittin-PPIX-NP的定量分析；*P＜0.05，**P＜0.01，***P ＜0.001。

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2.8 流式细胞仪检测α-melittin-PPIX-NP活化BMDC

检测结果显示，与PBS组比较，α-melittin-PPIX-NP组BMDC活化率显著升高（P＜0.01）；α-melittin-PPIX-NP+NIR组BMDC活化率显著高于α-melittin-PPIX-NP组和LPS组（P ＜0.001），表明α-melittin-PPIX-NP+NIR可以明显增强BMDC活化能力，见图8。

• 
  图8 流式细胞仪检测α-melittin-PPIX-NP体外对BMDCs的活化

  Figure8.Flow cytometry detection of in vitro activation of BMDCs by α-melittin-PPIX-NP

  注：A.细胞流式检测α-melittin-PPIX-NP体外激活BMDC；B.细胞流式检测BMDC体外活化定量分析；**P＜0.01，***P＜0.001。

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3 讨论

在癌症治疗领域，传统化疗和放疗方法的副作用及其对健康细胞的损伤，促使研究人员寻找更为精确和安全的治疗方法[15-16]，蜂毒肽因其对细胞膜的穿透能力而被视为潜在的抗肿瘤药物 [17]。蜂毒肽虽具有强大的细胞破坏能力，但缺乏特异性导致其对正常细胞同样具有毒性，这限制了它的应用范围[18]。Wang等[19]报道了通过纳米载体系统改善蜂毒肽的靶向性和生物安全性。Mooberry等[9]提出通过有效靶向SR-B1受体，增强了对肿瘤细胞的选择性杀伤。本研究将蜂毒肽进行改造，在其前端加上靶向SR-B1受体的α螺旋序列，改善了蜂毒肽的溶血活性，增加了对特定癌细胞的靶向能力。虽然该序列降低了对肿瘤细胞的杀伤作用，但其溶血副作用也大大减轻，提高了蜂毒肽的使用安全性。

此外，目前的研究表明，单一的多肽药物在体内极易发生降解[20-21]，难以达到理想效果。纳米载药系统可以延长在体内的循环时间[22]，成为一种可行的策略。通过纳米载体，可以保护蜂毒肽不被快速代谢和降解，延长其在体内的循环时间，同时减少对非靶向细胞的毒性影响。对蜂毒肽结构进行改造，虽然减轻了溶血副作用[19]，但同时也减弱了对细胞膜的打孔能力，为了弥补这一不足，本研究引入了疏水性光敏剂PPIX，在光动力疗法中，PPIX在适当波长的激光照射下，能够将细胞内的氧气和水转化为高活性的单线态氧和其他ROS[23]，这些ROS具有破坏细胞和组织结构的能力，有效地杀死肿瘤细胞[24]。本研究结果显示采用磷脂纳米递送系统结合PPIX，可以将蜂毒肽靶向递送到高表达SR-B1的B16-F10细胞中。在激光照射下，PPIX发挥PDT作用，α-melittin-PPIX-NP对肿瘤的杀伤作用提升，显著抑制B16-F10细胞增殖。

综上所述，本研究通过结合纳米技术和PDT对蜂毒肽进行改良和递送，有效提升了对黑色素瘤细胞的靶向治疗效果并显著降低了药物的副作用。通过在蜂毒肽分子前端添加靶向SR-B1受体的α螺旋序列，增强了其对肿瘤细胞的特异性，同时减少了对正常细胞的溶血副作用。此外，引入疏水性的PPIX并结合PDT产生ROS，进一步增强了肿瘤细胞的杀伤效果。这种纳米载药系统不仅提高了蜂毒肽的生物可用性和临床安全性，还通过物理和化学机制协同促进肿瘤细胞的凋亡，展示了一种综合性的癌症治疗新策略。但本研究未进行荷瘤小鼠动物实验，将来可以通过荷瘤小鼠验证α-melittin- PPIX-NP的抗肿瘤效果，并探究其抗肿瘤机制。通过小鼠活体示踪实验，评估α-melittin-PPIX-NP到达肿瘤部位的剂量，为黑色素瘤的诊治提供有益的探索。

伦理声明：本研究已获得武汉市红十字会医院伦理委员会审核批准（批号：2021023），华中农业大学伦理委员会审核批准（批号：HZAUMO-2024-0334）

作者贡献：研究设计：李三荣、耿园园；实验操作：耿园园、张燕；论文撰写和审定：李三荣、肖敏、张燕、耿园园

数据获取：本研究使用和分析数据请联系通讯作者获取

利益冲突声明：无

致谢：不适用

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