自身免疫性甲状腺疾病（autoimmune thyroid diseases，AITDs）是最常见的器官特异性自身免疫性疾病，影响约2%~5%的普通人群，其中女性（5%~15%）患病率显著高于男性（1%~5%） [1- 2]。最常见的AITDs是格雷夫斯病（Graves disease，GD）和自身免疫性甲状腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT），两者以甲状腺实质淋巴细胞浸润为共同病理特征，临床特征分别是甲状腺功能亢进症和甲状腺功能减退症[3]。有研究基于自身免疫监视理论提出了GD和AIT的共同起源假说[2]，但目前AITDs的确切发病机制仍未明确。
组织蛋白酶是在各种生理和病理过程中至关重要的蛋白水解酶。已知的15种人类组织蛋白酶根据其活性位点的氨基酸分为天冬氨酸蛋白酶（D，E）、半胱氨酸蛋白酶（B，C，F，H，K，L，O，S，V，X，W，Z）和丝氨酸蛋白酶（A，G）三类。这些酶主要作为溶酶体囊泡内的内肽酶，参与蛋白质降解、免疫系统调节、细胞应激信号传导、细胞代谢以及溶酶体介导的细胞死亡等过程，在维持细胞内环境稳态中发挥重要作用[4-5]。在甲状腺中，组织蛋白酶是参与甲状腺球蛋白（thyroglobulin，Tg）水解的主要酶，受促甲状腺激素的调节介导甲状腺激素的释放以维持正常的甲状腺功能；抑制组织蛋白酶活性可阻止Tg降解[6-7]。研究发现，与健康人群相比，GD患者甲状腺组织中组织蛋白酶B表达增加2倍，组织蛋白酶D表达增加2.3倍[8-9]。然而，组织蛋白酶与AITDs之间的因果关系尚未明确，且观察性研究易出现选择偏倚、残余混杂和反向因果关系，需进一步研究以明确其关联机制。
孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）是一种广泛使用的流行病学方法，通过利用与暴露相关的遗传变异作为工具推断暴露与结果之间的潜在因果关系。由于等位基因在减数分裂时是随机分配的，遗传工具相对独立于环境变量，不受疾病过程的影响，从而最大限度地减少了传统观察性研究中残留混杂和反向因果关系的潜在偏倚[10]。常规MR方法包括逆方差加权（inverse variance weighted，IVW）、加权中位数（weighted median，WM）、MR-Egger等，用于确保结果的稳健性。与传统MR相比，基于广义汇总数据的MR（generalized summary data based MR，GSMR）具有明显的优势，其考虑遗传变异之间的连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）使分析更加有效。此外，GSMR采用依赖工具异质性（heterogeneity in dependent instruments，HEIDI）测试检测工具异常值并消除多效单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms，SNPs）[3]。鉴于既往观察性研究并未明确组织蛋白酶与AITDs之间的因果关系，本研究拟利用大规模全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）的基因型和表型数据，应用GSMR、双向双样本MR和多变量MR（multivariable MR，MVMR）探讨两者之间因果关系，并通过将GWAS数据与血浆蛋白质定量性状位点（protein quantitative trait loci，pQTL）相结合，在蛋白水平验证因果联系，为AITDs的潜在机制研究提供参考。
1 资料与方法
1.1 数据来源
本研究分析的数据来自两项欧洲人群独立的GWAS公开数据集。其中，9种组织蛋白酶的血浆GWAS汇总统计数据来自INTERVAL研究，该研究涉及3 301名欧洲参与者[11]，相关数据在https://gwas.mrcieu.ac.uk上公开。4种AITDs（AIT、自身免疫性甲状腺功能亢进症、GD、自身免疫性甲状腺功能减退症）的GWAS汇总统计数据来自FinnGen生物样本库（https://www.finngen.fi/en），4种AITDs表型具体定义公开于https://r11.risteys.finregistry.fi。附件表1列出了MR分析中使用的GWAS数据集的详细信息。所有研究均经过各自机构伦理审查委员会的审核批准，并获得参与者的书面知情同意，因此，此项MR研究无需额外的伦理批准或许可。
1.2 工具变量筛选
为确保无偏倚的因果效应，用于MR分析的工具变量须满足相关性假设、独立性假设、排他性假设三个核心假设[12]。为识别与暴露因素相关的SNPs并确保组织蛋白酶与AITDs间因果关系的有效性和准确性，按照以下步骤选择最合适的SNP作为工具变量：由于可用于MR分析的SNP有限，组织蛋白酶以P＜5×10-6为显著性阈值，用于检测与所研究的暴露具有强相关的SNP。反向分析中，对于AITDs的遗传工具，以P＜5×10-8为显著性阈值；对于AIT的遗传工具，考虑到SNP较少，设置P＜5×10-6为显著性阈值[3]。为消除LD的存在，设定LD系数r2＜0.001且物理距离在10 000 kb以内，选择F＞10的工具变量以消除弱工具偏倚[13]。
1.3 pQTL数据获取及工具变量筛选
pQTL关联的汇总统计数据来自Ferkingstad等[14]研究的35 559例冰岛人群的蛋白数据库，含有4 907个血浆蛋白。顺式pQTL（cis-pQTL）提取条件为在相应基因位点上下游延伸1 000 kb范围内且ImpMAF＞0.01。pQTL与cis-pQTL遗传工具筛选条件为P＜5×10-8，LD系数r2=0.1且物理距离在10 000 kb以内。
1.4 统计学分析
本研究使用R 4.2.2软件中的Two-Sample MR和gsmr2包进行MR分析。采用双样本整合MR方法评估组织蛋白酶和AITDs之间的因果关联。使用GSMR作为主要分析方法，解释工具SNPs之间的弱LD，通过HEIDI-outlier测试＜0.01排除多效性证据的SNPs。使用包括IVW、MR-Egger、WM、加权模型和简单模型5种分析验证GSMR结果，其中IVW作为主要且可靠的分析方法[15]。不存在异质性（P＞0.05）时，IVW-MR选择固定效应模型；存在异质性（P ＜0.05）时，采用随机效应模型。以比值比（odds ratio，OR）评估组织蛋白酶与AITDs之间关系。通过MR-Egger截距法检验水平多效性[16]，通过Cochran's Q检验评估工具变量异质性 [13]，采用留一法对IVW-MR分析结果进行敏感性分析，以确保结果的稳健性。对具有因果关联的组织蛋白酶和AITDs进行反向MR分析及异质性、多效性检验和敏感性分析评估反向因果效应。通过MVMR分析，评估不同组织蛋白酶对AITDs的独立效应。通过pQTL MR分析在蛋白水平验证因果联系。P ＜0.05被认为具有统计学意义。
2 结果
2.1 组织蛋白酶对AITDs的因果效应
以9种组织蛋白酶为暴露因素，4种AITDs为结局，使用GSMR作为主要分析方法，结果显示组织蛋白酶F（cathepsin F，CTSF）显著降低GD风险[OR=0.91，95% CI（0.83，0.99），P=0.041]，见附件图1。IVW-MR分析结果亦显示，CTSF是GD的保护因素[OR=0.91，95%CI（0.83，0.99），P=0.031]，见附件图2，进一步验证了GSMR结果，未发现其它组织蛋白酶与AITDs存在因果关系（P＞0.05）。
2.2 AITDs对组织蛋白酶的因果效应
在反向MR分析中，以4种AITDs为暴露因素，9种组织蛋白酶为结局，使用GSMR作为主要分析方法，结果显示AIT[OR=1.07，95%CI（1.01，1.13），P=0.013]、自身免疫性甲状腺功能亢进症[OR=1.10，95%CI（1.03，1.17），P=0.003]以及GD [OR=1.08，95%CI（1.02，1.14），P=0.014]均与组织蛋白酶Z（cathepsin Z，CTSZ）显著正相关；自身免疫性甲状腺功能亢进症与CTSF显著负相关[OR=0.94，95%CI（0.88，0.99），P= 0.044]，见附件图3。IVW-MR分析进一步确认了AIT、自身免疫性甲状腺功能亢进症以及GD与CTSZ之间显著正相关，见附件图2，未发现其它AITDs对组织蛋白酶存在因果关系（P＞0.05）。
2.3 敏感性分析
敏感性分析结果显示，上述GSMR分析阳性结果不存在异质性（P值均＞0.05），也未表现出水平多效性（MR-Egger截距法P值均＞0.05），证明了因果关系结果的稳健可信（表1）。
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表格1 敏感性分析
Table1.Sensitivity analysis
注：CTSF.组织蛋白酶F；AIT.自身免疫性甲状腺炎；GD.格雷夫斯病；CTSZ.组织蛋白酶Z。
2.4 MVMR分析
MVMR分析校正其他组织蛋白酶影响后，结果显示，CTSF显著降低GD发生风险[OR=0.89，95%CI（0.80，0.98），P=0.018]，见附件图4。异质性检验Q值为90.31，P值为0.530；水平多效性检验MR-Egger截距值为-0.009，P值为0.061，表明MVMR分析结果较为稳定。
2.5 cis-pQTL MR 分析
cis-pQTL MR分析显示，CTSF显著降低GD发生风险[OR=0.76，95%CI（0.60，0.96），P=0.023]，见附件图5。异质性检验显示SNP之间存在异质性（IVW-Cochran Q值=32.34，P=0.009）；水平多效性检验MR-Egger截距值= 0.25，P值=0.388，显示无水平多效性。
3 讨论
本研究探索性利用GWAS数据库数据进行MR分析，探讨组织蛋白酶与AITDs之间的因果关系。GSMR和正向MR分析发现CTSF与GD易感性呈负相关，反向MR分析显示两者间不存在反向因果关联；MVMR分析校正其他组织蛋白酶影响后，CTSF与GD因果关系仍显著，并进一步得到了cis-pQTL MR分析的验证。以上结果表明CTSF是GD发生的潜在保护因素，但迄今为止尚缺乏临床证据。
CTSF是一种木瓜蛋白酶家族的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。已知半胱氨酸蛋白酶在炎症相关疾病（包括自身免疫性疾病）的发生和进展中发挥重要作用，其机制可能涉及抗原加工、炎症调节、细胞增殖与凋亡、蛋白质降解、细胞信号传导和激素加工等多个方面[17-19]。
甲状腺是由单层甲状腺上皮细胞构建的甲状腺滤泡组成的内分泌器官，是半胱氨酸蛋白酶发挥重要作用的器官之一[6]。本研究发现CTSF降低GD发生风险。与许多其他组织蛋白酶只能在特定细胞类型和黏膜组织中发现不同，CTSF在大多数免疫组织中普遍表达，参与不同水平的先天性和适应性免疫反应[20-21]。最熟知的是CTSF对主要组织相容性复合物II类抗原呈递、细胞毒性淋巴细胞自我保护、细胞因子降解以及炎症调节方面的作用[4, 21-23]。CTSF活性失调可促进自身抗原的出现和随后的自身免疫反应[23]，与GD的发病、进展和疾病严重程度尤其相关。此外，CTSF可以通过影响IL-1β和TNF-α等炎症细胞因子调节炎症反应[23]，而既往Meta分析显示炎症细胞因子水平升高会影响GD发病风险[24]。也有研究表明，CTSF在细胞凋亡过程中也发挥重要作用[21, 25]。而在GD中，甲状腺细胞死亡和存活间的平衡通过凋亡和抗凋亡基因表达的改变而改变 [26- 27]。CTSF可减少抗凋亡蛋白Bcl-2表达从而促进细胞凋亡[25]，这可能是CTSF参与调节GD甲状腺细胞凋亡从而维持甲状腺细胞稳态的原因之一。另外，作为暴露因素CTSF替代指标的SNP为SNP rs1260326，其位于CTSF基因的调控区域。从遗传学角度说，调控区域的变化可改变转录因子结合位点，SNP rs1260326可能通过影响启动子活性来调节CTSF的表达水平[24]。可见，CTSF通过调节抗原呈递和炎症反应在GD免疫系统中发挥作用，也促进甲状腺细胞凋亡，其表达水平的变化可能与甲状腺免疫炎症反应有关，从而通过多途径降低GD发生风险。
本研究也发现，AIT、自身免疫性甲状腺功能亢进症以及GD均与CTSZ存在因果关系，但目前相关文献报道很少，仍需更多的研究进行探索和验证。
本研究具有以下优势：首先，利用基于基因变异的MR分析可最大限度减少混杂因素和反向因果偏倚的影响。其次，双样本双向MR、MVMR等联合使用的整合MR有助于建立更强的变量间相关性。此外，GSMR方法的应用可减轻多效性和混杂因素的影响。最后，所有GWAS数据均来自欧洲血统人群，表明人口分层不太可能影响本研究结果。通过对遗传变异的研究，本研究为识别和研究CTSF作为GD的有效标志物提供了有价值的见解。然而，本研究也存在一定局限性：首先，本研究选择的样本均为欧洲血统，可能会限制研究结果在非欧洲血统人群中的普遍适用性。其次，本研究仅报告了组织蛋白酶与AITDs间的相互因果关系，且MR分析方法是一种理论因果分析方法，结果仍需通过动物实验和随机对照临床试验进一步验证，并探索CTSF降低GD发生风险的潜在机制。第三，公开可获得的 GWAS 数据库无法实现暴露和结果之间完全不重叠[28]。
总之，本研究结合GSMR、单变量MR和MVMR等方法分析了组织蛋白酶与AITDs之间的因果关系，研究显示，CTSF可显著降低GD发生风险，是GD的潜在保护因素。
附件见《医学新知》官网附录（https://yxxz.whuznhmedj.com/futureApi/storage/appendix/202501004.pdf）
伦理声明：不适用
作者贡献：数据获取：牟宗平、宋秀道；数据分析：于鹏程、宋秀道；文章撰写：殷美琦；论文审定：宋秀道；研究设计、基金支持：殷美琦、宋秀 道
数据获取：本研究中使用和（或）分析的数据可在公开数据库IEU OpenGWAS project（https://gwas.mrcieu.ac.uk/）以及FinnGen数据库（https://www.finngen.fi/）网站获取
利益冲突声明：无
致谢：不适用
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